موقع الو المحامي الصفران - مكتب محمد صالح المزيني - د النجراني - مطبخ درة طيبة رشاد - رشاد - مطعم طيبه الصليبيه - م سمرلاند 7 - حلويات وفطاير - د مازن الصواف امريكا - د/ فاتن - د.محمد حمد العتل كلية التربية الاساسية - مخبز الكفراوي - سليم فني ستلايت - د دوينا - مفسر احلام قطر - سكرتيره د.خالده مجيبل - المدعي العام منتهى الهاجري - بندر بامشموس - بوريان الشيخ - رقم بنك الاهلي - سالم الحجوري - ام نايف - المحامي/ سعد الجريوي - شيخ المندي لبن - نصر النقيب دكتور - مطعم كشري السوهاجي مهبوله - فيفا واتس مباشر - وادي عدي للعلاج بلرقيه - Nonish - جدة حسين - د. نوف المكراد - ضويان عبدالله ابو ايمن - Btool M7md - تركي عرار ال خريم - العميد/عدنان نوري - د ترابي (العيون) - دينا فتياني - سامر جنيدان - نصار مسفر عبيد العكشان العجمي - مطعم روستو صباح الاحمد - د عصام الراوي - دكتورة منال - تم تعريفه كمتطفل - كشري التحرير جهراء - د حسان الهايس - مطعم زين العقيله راشد - د. الياس حنوش سوريا - د/ اروي دعوجي - د. اروى ربيع - دكتور كامل الرشيد استشاري كلى - هيفا اندنوسي -
الجديد أربوسة والكرية أنظر أيضاً - غري دوجي (شغŒخ موسي) - أغلبية بسيطة (توضيح) - نشا الذرة في التاريخ - جو لويس - أنكي فان غرونسفين الميداليات - الريرمون طالع أيضا - جزيرة سالاواتي -
آخر المشاهدات الخنيشات - جود الغامض ملخص الرواية - هاتف وعنوان مطعم هرفي - ابها - ملف شامل لاهم وصفات الدكتور عادل عبد العال لعلاج الامراض المختلفة بالاعشاب - هاتف وعنوان مستوصف النصر الطبي - سكاكا, الجوف - سلسلة باون التفاعلية أساس النظرية - زياد مولوي - أبو عيسى الوراق رؤيته للإسلام - ابن أبي محلي نسبه - دراسة جدوى مفصلة لمشروع صناعة المنتجات الجلدية - تايه في أمريكا (فيلم) قصة الفيلم - ظاهرة تندل - اختصارات مستخدمة في الوصفات الطبية - قائمة الرموز المستخدمة في الفيزياء اللاتينية - بيرانتيل باموات الاستخدام الطبي - إخلاص المسباح من أهم الأعمال - سيليكون (مركب كيميائي) خواصها - ببغاء فوربس - عمار غول السيرة الذاتية - جوزيه بيزيرو مسيرته التدريبية - عبد الرحمن الشبيلي حياته الخاصة - الاستعلام عن كفالات الأشخاص بالكويت - علاء الدين (حكاية) ملخص الحكاية - إغراء (فيلم) تمثيل - الحليلة السكان - هواتف مكتب الضمان الاجتماعى بنجران ومعلومات عنها بالسعودية - هاتف مركز هيئة الخالدية بتبوك لهيئة الامر بالمعروف و النهى عن المنكر بالسعودية - علاج بالاستخلاب تاريخ العلاج بالاستخلاب - خولات - مقياس حرارة تاريخ تطور المحرار - شحوح نسب الشحوح - قائمة شخصيات دراغون بول فكرة إنشاء السلسلة - قبيلة الرميلات - داسيا سولنزا - طريقة تحضير كوكتيل السانجريا"Sangria" بطريقة سهلة - [بحث جاهز للطباعة] بحث حول علم الكيمياء , كل ما يخص الكيمياء - - سعد بورشيد أعماله الفنية - هواتف الخطوط الجوية العربية السعودية في جمهورية السودان - وصفة العلاج باسماء الله الحسنى - عنوان و هواتف سفارة السعودية فى جمهورية باكستان الاسلامية ومعلومات شاملة عنها - الاثاث على الطرز الإنجليزية - بوتفوناست والاربعون لصا (مسلسل) القصة - جول دو بوليناك - أمهات في المنفى (فيلم) قصة الفيلم - فير زارا (فيلم هندي) القصة - مستشعر الحساسات الضوئية - وكالة سفر تعريف وكالة السفر - هاتف وعنوان مستشفى العميس الأهلي - صبيا, جازان - تشكيل تضاريس سطح الأرض عوامل نشأة التضاريس - مناخ الجزائر خصائص المناخ في الجزائر - صباح الخير يا وطنا (أغنية) كلمات الأغنية - طريقة عمل اقراص النعناع من مطبخ منال العالم - هاتف ومعلومات عن مستوصف المتحد الطبي بالرياض - هاتف وعنوان محل قلعة الصخور للأحجار الكريمة - الصفا, جدة - أدب إنجليزي الأدب الإنجليزي القديم (500-1100) - طاقة الشبكة البلورية - هاتف وعنوان مطاعم البندر - البريد, الدمام - طريقة اعداد مرق الشبزي الايراني بالذ طعم خطوة بخطوة - رهان (فيلم هندي) قصة الفلم - طريقة تحضير فتة المكدوس بالباذنجان من الشيف منال العالم - فناء (عمارة) تعريف الفناء - نيكولاس نيكلبي خلفية عن الرواية - جغرافيا طبية مفهوم الجغرافيا الطبية - همام بن مرة سيرته الذاتية - الفلاسفة الطبيعيون الفلسفة الطبيعية - صالح الفهدي السيرة الذاتية - مقارنة بين نظم الملفات معلومات عامة - أربوسة والكرية أنظر أيضاً - كار تسليت (مسلسل) القصة - دواء ستريزام - أنسجة نباتية الأنسجة المولدة - هاتف وعنوان مستشفى الملك فهد - ابو عريش, جازان - قائمة حلقات هجوم العمالقة قائمة الحلقات - إكس فيديوز أنظر أيضاً - ميزانية و تكاليف ودراسة جدوى مشروع إنتاج عيش الغراب - أقحوان زهرة الذهب أسماء أخرى - معلومات هامة عن سلالة دجاج الفيومى - هاتف وعنوان مجمع عيادات د/ جميل خطاب - الهفوف, الاحساء - هاتف و معلومات عن مستوصف دار السلام بالمدينة المنورة - قبيلة الهزازي أقسام قبيلة الهزازي - هواتف و معلومات عن جوازات منفذ الوديعة بالسعودية - متلازمة تسرب السائل النخاعي علامات و أعراض - الذل (فيلم) قصة الفيلم - معاهدة بلطة ليمان 1838 - الكشوف الجغرافية الإسبانية دوافع الكشوف الجغرافية الإسبانية - روبينيرول الاستخدامات الطبية - هيئة تفتيش القوات المسلحة (مصر) رؤساء الهيئة - المرازيق (قبيلة) نسب المرازيق - صدار مستخرج طبق الأصل عن قيد الميلاد بدل فاقد بالكويت - مستذئبو تيارسوليو وصف - وصفات خبير الأعشاب يوسف الشرفا - هواتف مستشفى عسير المركزي و معلومات عنها بعسير بالسعودية - وصفة بسيطة ومجربة لعلاج دوالي الساقين بالاعشاب - هواتف مستشفى الملك فهد و معلومات عنها فى بجــــــازان بالسعودية - عايدة أبو نوار وفاتها - الغفيلي بن زبن الضان نسبة - بدر بن عبد المحسن بن عبد العزيز آل سعود نشأته وتعليمه - مديح نبوي خصائص المديح النبوي - وصفة لعلاج التهاب المفاصل و آلام العضلات بخلطات الاعشاب - وصفات تعمل بالمنزل - هاتف مركز السلي الصحي بالرياض و معلومات عنه بالسعودية - هاتف و معلومات عن مطعم حلويات شيرين بالمدينة المنورة - أهم تطبيقات الهاتف المرتبطة بكأس العالم - مواضيع تقنية - الدالي (مسلسل) الدالي الجزء الأول - محمد الأخضر الأخضري السائحي مولده ونشأته - هواتف مؤسسة روافد الطرق للمقاولات ومعلومات عنها بالسعودية - أسلوب التعجب أنواع التعجب - هاتف وعنوان مطعم البيت العربي للمندي - خميس مشيط, عسير - مكافآت طلاب مدارس تحفيظ القرآن الكريم بالمملكة العربية السعودية - ضفدعية التّصنيف - هاتف وعنوان مستوصف سلامتك - حي النهضة, مدينة الرياض - مخاطر صاعق الحشرات الكهربائي - قبيلة المشاييخ نسب المشاييخ - رغداء شعراني أعمالها - رباط صليبي خلفي أعراض الإصابة - طريقة تحضير كيكة الفيمتو بالصور - محصرات قنوات الكالسيوم آلية فعلها الدوائي - جغرافيا ليبيا ملخص جغرافي - هاتف وعنوان المستشفى التخصصي بأبها - ابها, مدينة ابها - قصائد إيدا قصائد إيدا الشعرية - هيبوكلوريت الكالسيوم الخواص - [بحث جاهز للطباعة] مشروع تخرج محاسبة جاهزة doc , مشاريع تخرج محاسبة بكالوريوس - - اعشاب لحرق الدهون فى الجسم للتخسيس و النحافه - ذا بوبل (فيلم) - روحية حسن القليني حياتها - ترقيات في «الداخلية» من اخبار العربية نت - [بحث جاهز للطباعة] بحث عن حرب 6 اكتوبر 1973 بالصور pdf doc - - [بحث جاهز للطباعة] البلازما الحالة الرابعة للمادة و الغازية في الفيزياء و في الكيمياء - - سماق قرني أنظر أيضاً - [بحث جاهز للطباعة] بحث علمى حول النظرية الكلاسيكية و النيوكلاسيكية - - نخلة التمر معلومات عامة عن النخيل - ليالي الحلمية (مسلسل) أهم شخصيات المسلسل على مدار أجزائه الخمسة - تندغه - [بحث جاهز للطباعة] بحث علمى حول مادة الرياضيات - - الفضاء اللوني (ص ش ض) و (ص ش ق) الاستخدام - لهجة جنوبية لهجة منطقة عسير - تونة الزعنفة الصفراء الوصف - فريديريك فروبل لمحة عن حياته - الاختبار الدولي لإتقان الإنجليزية نماذج صيغة الامتحان - بائعة الورد قصة المسلسل - حلقات الديك نصائح للاستعمال - ازالة الام الركبة باستخدام زيت السمسم - القبضاي (مسلسل) قصة المسلسل - اسا اكيرا الحياة المبكرة - هاتف وعنوان مستشفى السلام - مكه الخريق, مكة المكرمة - علي ولد زايد من أقواله المشهورة في اليمن - قرية الصالحية في منطقة القصيم - ريجيمات ال 750 سعر حراري من رندا أخصائية التغذية بمركز رياض الهجن - حملة حرر الحلمة وصلات خاجية - وصفة هائلة من الطب البديل لعلاج النتؤات او الثؤلول او الثلول بالاعشاب - ميزانية و تكاليف ودراسة جدوى مشروع إنتاج دهانات بلاستيك - كريم سنجابي - سوفوكليس أهم أعماله - هاتف وعنوان مكتب عبد العزيز سعد عبد الله المقهوي - الهفوف, الاحساء - سلوك الإنسان الجنسي جوانب السلوك الجنسي للإنسان - جامعة أم درمان الإسلامية كلية الطب - معاهدة لندن (1913) - تنوين التنوين في الأسماء - خلية عضلية أنواع الخلايا العضلية - هاتف وعنوان مستوصف مركز البدري الطبي - المرسلات, مدينة الرياض - جوناثان كاسترو أوتو - عنيز ابوسالم الترباني نشأته - معقد التوافق النسيجي الكبير وظيفة جزيئات MHC - جون واطسون أوائل حياته - الطمحة (قبيلة) نسبهم - هاتف وعنوان مؤسسة مبارك اليوبي للادوات الصحية - مشرفه, جدة - جريدة وقائع كوردستان نماذج للمواضيع نشرت في الجريدة - هاتف و عنوان مدرسة يعقوب البصري ابتدائي تحفيظ بمنطقة الرياض بالسعودية - كربونات الصوديوم التحضير - لوحة المجاعة النص - ميزانية و تكاليف ودراسة جدوى مشروع فرز وتدريج الخضار والفاكهة - الرويبة (الجزائر) أصل التسمية - أندرو كونانان بدايات حياته - شروط نقل ملكية المؤسسات بالتنازل أو البيع بالسعودية - طريقة علاج الشرخ الشرجي في اسبوع واحد بإذن الله - ورم سرطاوي العلامات والأعراض - هاتف وعنوان مكتب محمد عبد الرحمن فقيه للإستقدام - العزيزيه, مكة المكرمة - وادي الفرع تاريخ وادي الفرع - المحلل اللغوي LL الحالة العامة - هواتف مؤسسة مريزيق بن رافد العنزي للتجارة والمقاولات ومعلومات عنها بالسعودية - محافظة بلجرشي التسمية - مرهم البواسير وتاثيره على غشاء البكارة - [تطوير الذات] 10 طرق اكيده لجذب ماتريدمن كتاب قانون الجذب للدكتور صلاح الراشد .. - موسوعة التنمية البشرية - سوارم (تطبيق) سمات - المعالجة بالسعادة (فيلم) القصة - تقني الأشعة طبيعة العمل - هستون انواع الهيستونات - محمد أحمد أبو رنات حياته الباكرة - ألكين تركيب الألكينات - هاتف و عنوان السفارة السعودية في الجزائر و معلومات عنها - معاهدة تافنة بنود المعاهدة - محمد بن هندي محمد بن هندي بن حميد - انعكاس الحظ (فيلم) بطولة - هاتف وعنوان مستشفى علوي تونسي وإخوانه - العزيزيه, مكة المكرمة - قاعدة التسعات - أسس تصميم وتنفيذ وصيانة الحدائق العامة بالسعودية - فوائد نبات المقل من عيادة العلاج بالاعشاب والطب البديل - هاتف وعنوان مستشفى عبيد التخصصي - الملز, مدينة الرياض - هاتف وعنوان مستشفى الأمين - الطائف المركزي, الطائف - أوطاط الحاج دلالة التسمية - مريء كسارة البندق الأعراض -
اليوم: الخميس 17 اكتوبر 2019 , الساعة: 1:28 ص / اسعار صرف العملات ليوم الخميس 17/10/2019


اعلانات
محرك البحث


لطخة ويسترن خطوات لطخة ويسترن

آخر تحديث منذ 3 سنة و 1 شهر 609 مشاهدة

شاركنا رأيك بالموضوع

خطوات لطخة ويسترن


تحضير الأنسجة



يمكن أخذ العينات من أنسجة كاملة أو من زراعة الخلايا. يتم كسر الأنسجة الصلبة ميكانيكيًا، في أغلب الأحيان، باستخدام خلاّط (لإحجام عينات كبيرة)، باستخدام مجنس homogenizer (للأحجام الأصغر)، أو الصوتنة بالصوتنة Sonication. يمكن كسر وفتح الخلايا بإحدى الطرق المذكورة أعلاه أيضًا.


يمكن توظيف العديد من المنظفات والأملاح والمحاليل لتشجيع التكسر الخلوي ولإذابة البروتينات. يتم أيضًا إضافة مثبطات (موانع) البروتييزات والفسفاتازات Protease and Phosphatase Inhibitors وذلك لمنع تآكل العينة بإنزيماتها الخاصة.


يتم استخدام مجموعة من التقنيات الميكانيكية والكيمياحيوية (البايوكيميائية) من ضمنها أيضًا العديد من أنواع التصفية و طرد مركزي الطرد المركزي لفصل أجزاء أو عضيات معينة من الخلايا.


image SDS-PAGE sample.png


الفصل الكهربائي للهلام


مفصلة فصل كهربائي للهلام


يتم فصل بروتينات العينة باستخدام فصل كهربائي الفصل الكهربائي . فصل البروتينات قد يكون باستخدام النقطة متوازنة الكهربة Isoelectric point (pI)، الوزن الجزيئي، الشحنة الكهربائية، أو مجموعة من هذه العوامل. طبيعة الفصل تعتمد على طريقة معالجة العينة وطبيعة الهلام.


إلى حد الآن، الطريقة الأكثر شيوعاً للفصل الكهربائي للهلام توظف هلامات متعدد الأكريلامايد polyacrylamide ومحاليل تحتوي على كبريتات دوديكل الصوديوم Sodium Dodecyl Sulfate (SDS).


SDS-PAGE أي (الفصل الكهربائي لهلام كبريتات دوديكل الصوديوم متعددالأكريلامايد SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis) تحافظ على سلسلة البروتيات في حالة مفككة denatured state حالماً يتم معالجتهم مع عوامل اختزال قوية للقضاء على الأشكال الثانوية والثالثية. (مثل تحويل الروابط ثنائية الكبريت S-S إلى SH و SH) وبذلك يسمح لفصل البروتينات حسب وزنهم الجزيئي. يتم تغطية البروتينات في العينة بكبريتات دوديكل الصوديوم السالبة الشحنة ونقلها إلى القطب الكهربائي الموجب الشحنة خلال شبكة الأكريلامايد في الهلام.

البروتينات الصغيرة تهاجر أسرع خلال هذه الشبكة وبذلك يتم فصل البروتينات حسب الحجم (عادة ما يتم قياسها بالكيلودالتون، kD، kiloDaltons). تركيز الأكريلامايد يحدد دقة الهلام - كلما زاد تركيز الأكريلامايد كلما زادت دقة البروتينات ذات الأوزان الجزيئية العالية. البروتينات تهاجر ببعد واحد خلال الهلام لأغلب اللطخات.

image SDS-PAGE Electrophoresis.png


WB-gel الهلام ويلاحظ فيه الدرج بصورة حزم زرقاء اللون بسبب الصبغة الزرقاء كوماسي بلو Coomassie Blue

يتم تحميل العينات في < >آبار في الهلام. يتم حفظ إحدي الأسطر للـ < >درج أو < >العلامات، وهما خليط متوفر تجارياً من عدة بروتينات معروفة الوزن الجزيئي، عادة ما تكون مصبوغة لكي تُظهر حزم ملونة مرئية.


أحد الأمثلة على الدرج، هو درج الأوزان الجزيئية الكامل المدى لشركة GE (كما في الشكل). عندما يتم تطبيق فرق الجهد على الهلام، تهاجر البروتينات ضمنه بسرع مختلفة. هذه المعدلات الزمنية المختلفة للتقدم ( حركة فصل كهربائي حركات الفصل الكهربائي المختلفة) تُفصل إلى < >حُزم ضم كل < >سطر.



من الممكن أيضاً استخدام هلام ثنائي الأبعاد الفصل الكهربائي ثنائي الأبعاد الذي يفصل البروتينات من عينة واحدة في بُعدين. البروتينات تفصل بحسب النقطة متوازنة الكهربة (تركيز أيونات الهيدروجين pH الذي تكون فيه الشحنة متعادلة) في البعد الأول، وبحسب الوزن الجزيئي في البعد الثاني.


النقل



من أجل جعل الوصول للبروتينات أسهل للاكتشاف بالأجسام المضادة، يتم نقلهم من الهلام إلى غشاء مصنوع من النيتروسيليوز أو الـPVDF. يتم وضع هذا الغشاء فوق الهلام، ووضع مجموعة من طبقات أوراق الترشيح فوق ذلك. ثم يتم وضع الطبقات كلها في محلول يقوم بالتنقل إلى الأعلى عبر الأوراق بالخاصية الشعرية Capillary action، جالباً البروتينات معه إلى الغشاء.


ومن الطرق الأخرى لنقل البروتينات تدعى اللطخة الكهربائية وتستخدم تياراً كهربائي لسحب البروتينات من الهلام إلى الغشاء.


البروتينات الآن نُقلت من داخل الهلام إلى سطح غشاء من النيتروسيليلوز أو PVDF مع ثباء الترتيب التي كانت البروتينات عليه داخل الهلام. ويكون ناتج هذه العملية، هو عرض البروتينات على سطح رقيق للاكتشاف (انظر أسفلاً). كلا نوعي الغشاء (نيتروسيليلوز أو PVDF) يتم اختيارهم لخاصية الالتصاق غير المحدد بالبروتيات (أي أنهم يلتصقون بأي بروتين بصورة متساوية). التصاق البروتينات مبني على تفاعلات مصابة بفوبيا الماء hydrophobic interactions)، بالإضافة إلى التفاعلات المشحونة بين الغشاء والبروتين. إن أغشية النيتروسيليلوز تكون أقل كلفة من الـ PVDF، ولكنهم هشة أكثر ولا تستطيع الوقوف لتحقيقات مجددة reprobes كثيرة.Renart J, Reiser J, Stark GR. Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera a method for studying antibody specificity and antigen structure , < >Proc  Natl  Acad  Sci  U  S  A, 1979 Jul 76(7) 3116-20. PMID   91164] [http //www.pnas.org/cgi/content/abstract/76/7/3116 abstract




image Western blot transfer.png


التأثير الكلّي والموحّد لنقل البروتين من الهلام إلى الغشاء يمكن التأكد منه بصبغ الغشاء بصبغة كوماسي Coomassie أو بونسو س Ponceau S. كوماسي هي الصبغة الأكثر حساسية من الصبغتين، بالرغم من أن سهولة ذوبان بونسو س في الماء تجعله أسهل للإزالة لاحقاً والتحقق من الغشاء كما في أدناه.
Towbin H, Staehelin T, Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets procedure and some applications < >Proc  Natl  Acad  Sci  U  S  A, 1979 Sep 76(9) 4350-4. PMID   388439] [http //www.pnas.org/cgi/content/abstract/76/9/4350 abstract




السد


بما أنه تم اختيار الغشاء لقابليته على الالتصاق بالبروتينات، وكلاً من الأجسام المضادة والأهداف هما بروتينات، يجب إتخاذ إجراءات خاصة لمنع التفاعلات بين الغشاء والجسم المضاد المستخدم لاكتشاف البروتين الهدف. يتم سد الالتصاق غير المحدد عن طريق وضع الغشاء في محلول مخفف من بروتين - عادة ما يكون هذا البروتين هو ألبومين مصل البقر Bovine Serum Albumin المعروف بالـ BSA أو حليب من غير دهون (كلاهما ليسا مكلفان)، مع مقدار صغير من منظف مثل توين 20 Tween. البروتين في المحلول المخفف يلتصق بالغشاء في كل الأماكن الغير محتوية على البروتينات الهدف. وبهذا، عندما يتم إضافة الجسم المضاد، لن يكون هناك مكان له ليلتصق غير على مواقع الالتصاق على البروتين الهدف المحدد. هذا يقلل التشويش في النتيجة النهائية للطخة ويسترن، ويؤدي إلى نتائج أوضح، ويقضي على النتائج الإيجابية المزيفة.


الاكتشاف


خلال عملية الاكتشاف، يتم التحقق من وجود البروتين المطلوب على الغشاء عن طريق جسم مضاد معدل مرتبط بإنزيم مراسل، الذي عند وضع مادة معينة عليه يسبب تفاعل لوني ويقوم بإنتاج لون معين. ولعدة أسباب، فإن هذه الخطوة تتم بخطوتين، بالرغم من أن الآن يوجد طرق اكتشاف ذات خطوة واحدة لبعض الاستخدامات.


الخطوتين


  • الجسم المضاد الأولي


  • يتم تكوين الأجسام المضادة عندما يتم عرض البروتين المطلوب (أو جزءاً منه) على المستضيف أو خلايا المناعة المزروعة. عادةً، يكون هذا جزءاً من الاستجابة المناعية، ولكن هنا يتم حصد الأجسام المضادة واستخدامها كأدوات اكتشاف دقيقة وحساسة تلتصق بالبروتين مباشرة.


    بعد عملية السد، يتم احتضان الغشاء في محلول مخفف من الجسم المضاد الأولي (عادة بتركيز بين 0,5 ميكروغرام /مل إلى 5 ميكروغرام/مل) مع التحريك الخفيف. بشكله النموذجي، يحتوي المحلول على محاليل ملحية مع نسبة صغيرة من المنظفات، وأحياناً مسحوق حليب أو ألبومين مصل البقر BSA. يمكن وضع محلول الجسم المضاد والغشاء معاً واحتضانهما لأي فترة بين 30 دقيقة إلى عبر الليل. ويمكن أيضاً احتضانهما في درجات حرارة مختلفة، حيث تكون الدرجات الدافئة أكثر محفزة على الالتصاق (لكلا نوعي الالتصاق، الالتصاق المحدد والالتصاق الغير محدد التشويش ).


  • الجسم المضاد الثانوي


  • بعد تنقيع الغشاء أو غسله لإزالة الأجسام المضادة الأولية الغير ملتصقة، يتم إضافة جسم مضاد آخر للغشاء، موجه نحو جزء خاص-لنوع species-specific الجسم المضاد الأولي. وهذا يعرف بالجسم المضاد الثانوي، وبسبب خواصه المستهدِفة، يتم تسميته بـ ضد-الفأر ، ضد-العنز ، ضد-الجرذ ، الخ. الأجسام المضادة تأتي من مصادر الحيوانات (أو زراعة خلايا هيبريدوما حيوانية)؛ فالجسم المضاد الثانوي ضد-الفأر سيلتصق لأي جسم مضاد أولي مصدره الفأر. وهذا يسمح لتوفير المصاريف بالسماح لكل المختبر من استخدام مصدر واحد من جسم مضاد منتج بكثرة، ويوفر نتائج منسقة أكثر بكثير. عادة ما يكون الجسم المضاد الثانوي مرتبط بجزيئة بايوتين أو إلى إنزيم مراسل مثل فسفاتاز قلوي Alkaline phosphatase أو بيروكسيداز الفجل الحار Horseradish peroxidase. هذا يعني أن عدة أجسام مضادة ثانوية ستلتصق بجسم مضاد أولي واحد وتقوم بتعزيز الإشارة للاكتشاف.

    image Western Blot binding.png


    غالباً ما يتم استخدام جسم مضاد ثانوي مرتبط ب بيروكسيداز الفجل مع عامل مضيء كيميائي، وينتج التفاعل بينهما ضوءاً بمقدار كمية البروتين. يتم استخدام طبقة حساسة من الفيلم الفوتوغرافي لخلق صورة للأجسام المضادة الملتصقة باللطخة.


    كما في إجراءات إيلايزا الإيلايزا إيلايزبوت الإيلايزبوت ، يمكن تزويد الأنزيم بجزيئة التي يحولها الإنزيم إلى ناتج تفاعل ملون يمكن رؤيته على الغشاء.


    البديل الثالث هو استخدام علامة مشعة بدل إنزيم متصل بالجسم المضاد الثانوي، مثل ربط بروتين يلتصق بالأجسام المضادة (مثل بروتين أ من العنقودية Staphylococcus) نظير بنظير مشع من يود اليود . ولكن بما أنه الطرق الأخرى هي أكثر أماناً، وأسرع وأرخص، قلّ ما يتم استخدام هذه الطريقة الآن.


    الخطوة الواحدة


    تأريخياً، كانت عملية التحقق تُجرى بخطوتين وذلك بسبب السهولة النسبية لإنتاج أجسام مضادة أولية وثانوية من ناحية المرونة، وأيضاً يضيف خطوة تكبير للإشارة لعملية الاكتشاف.


    نظراً للقدرة الإنتاجية العالية لتحليل البروتينات وانخفاض حدود الإشارة المطلوبة للكشف، تم تطوير طرق تحقُّق ذات خطوة واحدة والتي تستطيع أن تحدث بصورة أسرع مع تقليل استخدام المستهلكات. وهذا يتطلب جسم مضاد ملتقط الذي يتعرف على البروتين المطلوب ويحتوي على علامات اكتشاف/التقاط، وغالباً ما يكون هناك ملتقطات بروتينات مؤشرة للبروتينات المؤشرة Protein tags. يتم احتضان الملتقط الأولي مع الغشاء بطريقة مشابهة للجسم المضاد الأولي في طريقة الخطوتين، ومن ثم يكون جاهز للكشف بعد سلسلة من خطوات الغسل.


    Blotautoradiogram.png frame لطخة ويسترن باستخدام طريقة الاكتشاف المشع


    التحليل


    بعد أن يتم غسل الملتقطات الغير ملتصقة، تصبح لطخة ويسترن جاهزة للاكتشاف عن طريق الملتقطات الملتصقة بالبروتين المراد اكتشاف وجوده أو عدمه. في المصطلحات العملية، لا تُظهر كل لطخات ويسترن البروتين بصورة حزمة واحدة فقط على الغشاء.

    يتم أخذ تقديرات الحجم عن طريق مقارنة الحزم المكتشفة بحزم الدرج المصبوغة التي تم تحميلها عند خطوة الفصل الكهربائي. يتم إعادة هذه العملية لبروتين هيكلي، مثل الأكتين أو التيوبيولين، الذي لا يجب تغيير تركيزه بين العينات. كمية البروتين الموجودة تتم مقارنتها بالبروتين الهيكلي لكي يتم السيطرة على المجموعات العدة. هذه الطريقة تؤكد تصحيح التغييرات الدارجة بسبب عدم انتقال البروتين أو وجود أخطاء في التجربة.


    الاكتشاف اللوني Colorimetric detection


    طريقة الاكتشاف اللوني تعتمد على احتضان لطخة ويسترن مع المادة التي ستتفاعل مع الإنزيم المراسل (مثل بيروكسيداز البيروكسيداز Peroxidase) الذي يكون مرتبط بالجسم المضاد الثانوي. هذا يحول الصبغة الذائبة إلى شكل غير ذائب بلون مختلف والتي تترسب قرب الإنزيم وبالتالي تصبغ غشاء النيتروسيليلوز. يتم إيقاف تحميض اللطخة عندها عن طريق غسل الصبغة الذائبة. يتم تحليل كمية البروتينات باستخدام قياس الكثافة densitometry (أي ما هي كثافة البقعة/الصبغة) أو قياس الضوء spectrophotometry.


    الإضاءة الكيميائية Ch iluminescence




    تعتمد طريقة الاكتشاف بالإضاءة الكيميائية على احتضان لطخة ويسترن مع المادة التي تضيء عندما تتصل بالجزيء المراسل على الجسم المضاد الثانوي. وعندها يتم التقاط الضوء باستخدام فيلم فوتوغرافي ، ومؤخراً باستخدام كاميرات سي سي دي CCD cameras تلتقط صورة رقمية للطخة ويسترن. هذه الصورة يتم تحليلها باستخدام مقياس الكثافة الذي يحلل كمية الصبغة البروتينية النسبية ويقوم بالتحليل الكمي عن طريق الكثافة الضوئية. يوجد برامج جديدة تساعد على تحليلات البيانات بصورة أخرى مثل تحليل الوزن الجزيئي إذا تم استخدام مقاييس صحيحة. يعتبر ما يسمى ب المضيء الكيميائي المحسن Enhanced ch iluminscent أو ECL هو من ضمن أكثر الطرق حساسية للاكتشاف التحليلي للطخة ويسترن.


    image Western blot ch iluminescent detection.png



    الاكتشاف المشع Radioactive detection


    العلامات المشعة لا تحتاج إلى مواد إنزيمية، ولكن فقط وضع أفلام أشعة سينية طبية مباشرة على لطخة ويسترن والذي يقوم بخلق أجزاء غامقة على الفيلم تعود إلى حزم البروتينات المطلوب كشفها (انظر الصورة). قلت أهمية طرق الاكتشاف المشع، بسبب كونها مكلفة، ولها أخطار صحية عالية، كما أن المضيء الكيميائي المحسن ECL يعتبر بدل مفيد جداً.


    الاكتشاف الفلوري Fluorescent detection


    يتم تحفيز الملتقط ذو العلامات الفلورية بواسطة الضوء والانبعاث من التحفيز وبذلك يتم الاستدلال عليه بواسطة متحسس ضوئي مثل كاميرا سي سي دي المزودة بمرشح باعث مناسب حيث يقوم بألتقاط الصورة الرقمية للطخة ويسترن ويقوم بالسماح لتحليل بيانات أخرى كالوزن الجزيئي والتحليل الكمي للطخة ويسترن. يعتبر الملتقط الفلوري من بين أكثر الطُرق حساسية لتحليل اللطخة.


    التحقق الثانوي


    أحد الاختلافات الكبيرة بين غشائي النيتروسيليلوز و PVDF يعود إلى قابلية كل منهم على القيام بـ تعرية للأجسام المضادة وإعادة الاستخدام لأجسام مضادة ملتقطة لاحقاً. وبالرغم من أن هناك طرق مختبرة لتعرية أغشية النيتروسيليلوز، تظل أغشية الـPVDF أسهل تعرية، وتسهل استخدام أكثر قبل أن يقوم التشويش الخلفي بإعاقة التجارب. أحد الاختلافات الأخرى هو، بعكس النيتروسيليلوز، الـPVDF يجب أن ينقع في 95 إيثانول، بروبانول أو ميثانول قبل الاستخدام. أغشية الـPVDF أيضاً تكون أكثر سمكاً وأكثر مقاومة للضرر خلال الاستخدام.


    الفصل الكهربائي للهلام ببعدين


    2D-SDS-PAGE ثنائي الأبعاد يستعمل المبادئ والتقنيات المُشار إليها اعلاه. كما يشير الاسم، فإن هذه الطريقة تشمل هجرة سلسلة البروتينات في بعدين. في البُعد الأول تقوم السلسلة البروتينية بالأنفصال حسب نقطة التعادل الكهربي. أما في البعد الثاني تنفصل السلسلة البروتينية حسب وزنها الجزيئي. تُقاس نقطة التعادل الكهربي لبروتين مُعين بواسطة الرقم النسبي للأحماض الأمينية الموجبة (ك لايسين اللايسين ) والسالبة (ك جلوتاميت الجلوتاميت ), وتقوم الأحماض الأمينية السالبة بتزويد أعلى نقطة تعادل كهربي, ومن جهة أخرى تقوم الأحماض الامينية الموجبة بتزويد أقل نقطة تعادل كهربي.


    تسمح هذه الطريقة بفصل كل البروتينات الخلوية على هلام مفرد وكبير. من الفوائد المهمة لهذه الطريقة هي التمييز بين الأشكال المُختلفة لبروتين مُعين (مثلاَ البروتين الذي تمت فسفرتهُ، أي إضافة المجموعة السالبة الشُحنة). يُمكن قطع البروتين الذي تم فَصله من الهُلام وبعدها يتم تحليله بواسطة جهاز تحليل الكتلة mass spectrometry الذي يقوم باكتشاف البروتين وتحديد هويته.


    الاستخدامات في الفحص الطبي




    الطرق


  • طريقة مختبر الدكتور مارك بارتون فرانك


  • Western Blot.png تصغير لطخة ويسترن

    في تقانة حيوية التقنيات الحيوية ، لطخة ويسترن إنج Western Blot (تعرف أيضا باللطخة المناعية Immunoblot) هي طريقة اكتشاف بروتين معين في عينة أو مستخلص أنسجة، وهي من التقنيات الحيوية المخبرية. تستخدم الفصل الكهربائي للهلام لفصل البروتينات الطبيعية native proteins أو بروتين مفكك البروتينات المُتَمَسِّخة denatured proteins حسب طول السلاسل البروتينية (ظروف مفككة) أو حسب الشكل الثلاثي الأبعاد للبروتين (ظروف قومية/غير مفككة). يتم، في ما بعد، نقل البروتينات إلى غشاء (عادة ما يكون الغشاء مصنوعا من مادة نيتروسيليلوز النيتروسيليلوز أو PVDF )، حيث يتم التحقق (الاكتشاف) باستخدام أضداد مخصصة للبروتين الهدف. هناك الآن العديد من شركات المواد التي تتخصص في تجهيز أضداد (مستنسخة ومتعددة النسائل) ضد آلاف البروتينات المختلفة. وقد قام هذا بتقليل الوقت الذي تحتاجه لعمل لطخة بصورة كبيرة.



    كان يجب، سابقًا، تلقيح الحيوانات الكبيرة (مثل خروف الخرفان ، عنز العنز - يحتويان على الكثير من مصل المصل ) بالبروتين المستهدف مرتين (حيث أن الاستجابة المناعية الثانية تنتج أضدادا أكثر). ومن ثم إما يتم تصفية المصل واستخدامه (أضداد متعددة النسائل - Polyclonal -) أو يمكن فصل الخلايا البائية من الحيوان ودمجها خارج الجسم < >in vitro مع خلايا فأر سرطان سرطانية لتوليد خلايا هيبريدوما التي تستطيع في ما بعد إنتاج أضداد وحيدة النسيلة (Monoclonal).



    الأضداد التجارية عادة ما تكون مكلفة، ولكن يمكن إعادة استخدامها (استخدام ما يتبقى من الأجسام المضادة غير الملتصقة) بين التجارب. هذه الطريقة تستخدم في الأحياء الجزيئية ، الكيمياء الحيوية ، و علم الجينات المناعية Immunogenetics وعدة أخرى من علوم الأحياء الجزيئية.


    من التقنيات الأخرى المتعلقة هي استخدام الأجسام المضادة لاكتشاف البروتينات في الأنسجة أو الخلايا باستخدام صبغة مناعية الصبغة المناعية Immunostaining و إلايزا الإلايزا ELISA.


    تم صنع هذه الطريقة في مختبر جورج ستارك في جامعة ستانفورد عام 1981. قام وولتر نيل بورنيت بتسميتها باسم لطخة ويسترن ، Cite journal
    author W. Neal Burnette

    'Western blotting' electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate — polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A

    journal Anal Bioch


    year 1981

    month April

    volume 112

    issue 2

    pages 195-203



    PMID   6266278] [http //dx.doi.org/10.1016/0003-2697(81)90281-5 doi 10.1016/0003-2697(81)90281-5
    Citation's Classic Burnette



    وهو مشتق من اسم لطخة جنوبية اللطخة الجنوبية (Southern Blot لغة إنكليزية بالإنكليزية ، من Southern وهي نسبة إلى إدون ساذرن Edwin Southern، والتي تعني أيضا الجنوبي لغة إنكليزية بالإنكليزية . فسميت التقنية الجديدة بـويسترن، تلاعبا بالمعنى). و لطخة جنوبية اللطخة الجنوبية تقنية لاكتشاف حمن الحمض الريبي النووي منقوص الأكسجين DNA، قام إدون ساذرن Edwin Southern بصنعها عام 1975. تسمى طريقة اكتشاف حرن الحمض الريبي النووي RNA باسم لطخة شمالية اللطخة الشمالية .

     
    التعليقات (1 تعليق)

    (اضيف قبل 2 سنة و 3 شهر)
    تبليغ عن اساءة

    انسخ الارقام تحتهم


    زائر     طلب حذف التعليق
    مفيد جداً
     


    تصنيفات الموقع
    شاهد الجديد لهذه المواقع
    بئر السبع ميسوكسيمايد تل هشومير المرجة الزرقاء أسامة بن زيد الغاف دراسة جدوى خطة عمل روبرك الطاقة الداخلية مذكرات دورية نحو الشرق ايو جيما العياضي برباس العياضي شركة مكافحة حشرات خوارزمية ديكسترا مرفأ بيروت الكايد طاش ما طاش شركة كايد البسقلون كورونا سد حراض الفن البيزنطي عبد السلام بنعبد العالي رائد عودة مستشفى طيبة التخصصي غزوة خيبر شركة فواز لعامة للدراسات والمستندات كلوفيس الأول لمع جميل خطاب ويلان نظم المعلومات المحاسبية محمود بن محمود البان باقادر مؤسسة بن شيهون الصحة الصين معلمات اتجاه البطولي أرضروم تنافسية محمد الحاج سالم تكرلي مبرهنة عدم الاكتمال علاج عرق النسا سنهدريم كهربا الحكومة الحكومة التونسية معاهدة فاليتا مستشفي بدر مشاغل مراكز التجميل محمد حافظ الشريدة وديع سعادة مشغل جرافيزم الربان حديقة التجارة نقليات الهباس بن دعجم بطباط حمود بوعلام حميدة معركة ثابسوس براتا البن الاخضر الزكاه ديدفورت تاريخ فواصل الكتب توسعة المسجد النبوي نادي الفتح telnet 1978 عصبام اللوزتين سبيكمان 213 الاقتصاد رمادي عادي فندق العليا تشويه سمعه اسماك الأسماك الجهاز القلبي الوعائي italia قراي سجاد الجامعة السويسرية المفتوحة بيرو هاري فواز الحاتم الفم تمسكنت فتمكنت مقالي سهير أومري