أعلانات الحراج بيع ركشات بالتقسيط - شمعة الوردة الموسيقية الدوارة - قليبية وحمام الغزازو الزهراء - ميكروويف LG تاتش /موديل MH7048AS - حاله ممتازة - ستوديو مفروش في حي الخضراء تونس - Ikea Harte LED Lamp White - ارض للبيع في صنعاء العشاش علي شارع الخمسين - أبحث عن منزل للكراء في بنزرت - للبيع شقة في الرقعي - مطلوب موظفات اناث للعمل في مصنع خياطه والتوظيف فوري - بيعه سريعه علي التوقيع قسيمه في الوفره القائم دورين - للايجار استديو - العدان ق ظ، شظ¤ظ¤ مظ،ظ§ - Contact Us For Trade License Family Visa Online - Single Bedroom Set Sale Have Discount contact - Please contact me - 2 YEARS OLD LICENCE LOOKING DRIVER JOB -054 4141143 contact - House shafting contact plz - Fish+fishhouse ( contact me in my mobile number) - I am driver having license from saudi govt I want Job plz contact me - Just Contact by Call, WhatsApp and Email for FREE Building Demolition - I need iPhone please contact - باص فوكسي تويوتا 2007 - منزل نظيف دورين في شارع الصريم للايجار - للبيع فلل وحمه صباح الاحمد ام الهيمان جابر العلي المنقف الظهر - محل فى نادى الحاراتى داخل الخمس المدينة - رقدالين _ شقة ايجار - ماذون شرعي طرابلس ليبيا - مطلوب مندوب كاش فان مع باص - تاج مول-شبنة - بيعه سريعه بالنسيم قظ¢ للجادين اليوم - للايجار بالنسيم دور ارضي وشقق تشطيب ملكي جديد بسعر مغري - شقة للايجار الرصيفة /حي العراتفة - مشدات للجسم للرجال والنساء - عزاقة نوع ناردي للبيع - استراحة بتاجوراء الباعيش خلف منتزه مدهش لاند - جنسس للبيع فول فول - تاكوما 2002 نضييف كررررررت للبيع - اسدال - عود بهجة من بن شيخان - سواتر و مظلات الرياض www.sawatr.com/ سواتر ومظلات الاختيارالاول التظليل الحديث لتركيب مظلات السيارات واعمال السواتر بالرياض - جدة - الدمام - خميس مشيط - ابها - المدينة - محرك دايو سيلو - زيت الحشيش الافغاني خالي من المواد الكيميائيه وعباره عن مجموعه من الزيوت والاعشا - منظف كلينر - للبيع سيارة فلوكس واجن طوارق 2011 بالكويت - معدات قوميستي ماكينة الرصاص شبه قاعدة جديدة وباقي مستعمل بش هلبا اقل حتي من 5شهور - شارع هايل - شقه مفروشه للايجار الدوار السابع بجانب كوزمو - ايجار بيت وشقه - salon & Matrial for sale -
موقع الو فصاد القصيم - صالون هلي - هيله الركف - ابو خالد تاجير عمال - نوره بنك اسكان - مطعم سماسم فطاير9تنفيذأحكام - صالون دانه الطويرش - مركز البلسم الشافي - ماجد العبيدالله المراسم الملكيه - بقاله ق1 - عيادة الدكتور ميثم الصددي - الشيخ/ خالد البلطان رئيس الشباب - د اسامة ثروت لطيف سوهاج - المروج/عبدالرحمن الغانم - Vip - يحيا زكريا الوعب - لمياء وزه - خيام مضحي النمران - د عصام توفيق سلطان - دكتور حيدر الزبيدي - شاورما كلاسيك - المحامي محمد الهريني - ناصر عبدالعزيز البشر - بشار رباح سكرتيره مريانا - بقالة حبايب العارضية - مطعم دقيقة واحدة - العقيد د فراج آل الشيخ قصر الامير سلطان - مكتب محامى حسام التنيب - مصبغه الماسه مجمع العاقول - الدكتور يعقوب - سلمى البقشي - النجف فندق لؤلؤة البحر - نايف الوثلان - فهد شباب - د ابراهيم - Palig Ashodian .H - بقالة عبدالله مبارك - مدرسة النهروان - الدكتور فيصل العمر - مروان الحوباني - خياط كاميو شاطر خالديه ق8 ش80 م 6 - شاي ساره العجمي للتنحيف - معهد القمه الفروانيه - دكتور عمر باطوق جده - د وائل محسن - مشاوي حسيل - مستشفى الخفجي - مكتبة مكي محمود - معلم حبوش - د.اسامه التيناوي -
الجديد شركة القُصير السعودية لتأجير وبيع الخيـام الأوروبية ومولدات الكهرباء - الصلاة الصلاة - كيف ازرع النعناع في المنزل ؟ - فوائد التمر والحليب - كيف توفر العديد من المال على نفسك ؟ - كيف تبداء بمشروع صغير وناجح ؟ - كيف تصبح غنياً ؟ - كيف توفر المال ؟ -
آخر المشاهدات خدمة تبليغ عن تسمم في مطعم بالمملكة العربية السعودية - استشارة قانونية حول اجراءات الطلاق طبقا للقانون الكويتي - ميكرومتر (جهاز قياس) مكونات جهاز الميكرومتر العادي - عيسى الناعوري أعمالة و مؤلفاتة - مزايا أن تكون خجولا (رواية) الأدب - هاتف وعنوان مستوصف الجزيرة - النسيم, مدينة الرياض - رمانة وبرطال (مسلسل) القصة - دراسة جدوى لمشروع صناعة خراطيم الري بالتنقيط من المطاط المعاد تدويره - الزرقان (قبيلة) أصل ونسب الزرقان - وصفة لعلاج الربو و حساسية الصدر بالاعشاب الطبيعية - بنو سهم نسبهم - خواص العلاقات على المجموعة أولا خاصية الانعكاس - عنوان و هواتف قنصلية السعودية فى الإسكندرية ومعلومات شاملة عنها - دورة كارنو وصف دورة كارنو - احكام عامة للتعرفة الجمركية بمصلحة الجمارك السعودية - العث السمين مواصفاتها - علاج الجلطة الدماغية و الشلل النصفي - زمرة (رياضيات) تعريف وتوضيح - محاولة عيش كاتب الرواية - هاتف وعنوان مستشفى رعاية الرياض - طريق خريص, مدينة الرياض - هاتف وعنوان بودي شوب كمال عثمان جمجوم - الباحة - فكرها صح (برنامج) الالعاب والمسابقات - طريقة عمل مفركة البطاطا من حلقات برنامج منال العالم - البوابة التاسعة (فيلم) القصة - وصفة لعلاج التبول اللاإرادي عند الأطفال بخلطات الاعشاب - وصفات تعمل بالمنزل - خصائص الوصف انواع الوصف - جريان الموائع معادلات حركة السوائل - معلومات هامة عن سلالة دجاج الجميزة - وصفة لعلاج سلس البراز بالاعشاب الطبيعية - مقياس غلاسكو للغيبوبة عناصر الجدول - جغرافيا إقليمية مفهوم الجغرافيا الإقليمية - مزايا وعيوب شركات التوصية البسيطة وهل تصلح للمشروعات الصغيرة - كوربا (حاسوب) نظرة عامة (مقدمة) - قسم رقم 8 (فلم) قصة الفلم - نظرية التراكب - كلوريد الحديد الثلاثي الخواص - أحمد اللبابيدي حياته ونشأته - هاتف وعنوان مستشفى الجدعاني - الصفا, جدة - الجرافيزم - صالح أوقروت السيرة الذاتية - سور القران لكل شهر من شهور الحمل - عنوان و هواتف سفارة السعودية فى جمهورية السودان ومعلومات شاملة عنها - كيف تحصل علي المتعة في الحياة الجنسية - ميزانية و تكاليف ودراسة جدوى مشروع إنتاج أحذية جلدية للتصدير - عبطان السعدون معركة جو لبن - عثمان بلوزداد - طريقة عمل ومقادير أصابع الموزاريلا من مطبخ منال العالم - تفاعل حاد للكرب العلامات والأعراض - منطقة مرشنج - حثل أو تنكس المادة البيضاء في الدماغ - طريقة عمل الملاتيت الفلسطينيه لا تفوتك - وصفة هائلة من الطب البديل لعلاج امراض القدم والارجل بالاعشاب - هذال بن وقيان - هاتف وعنوان مستوصف عرعر الأهلي - عرعر - هاتف وعنوان شركة مصنع جمجوم للصناعات الطبية المحدودة - العليا, مدينة الرياض - تعتيق اللحوم كيفية تعتيق اللحوم - إسماعيل بن موسى منك السيرة الذاتية - مصباح نيون فكرة العمل - إيكاريام المستعمرة - هاتف وعنوان مطعم مشوار - حائل - كنيسة المهد تاريخ - طريقة عمل وصفة الكراوية من منال العالم - طريقة عمل أطيب برياني دجاج مثل المطاعم - اكلات من المطبخ الكويتي - جغرافيا اليابان المظاهر الطبيعية - روفيو إنترتينمنت - [بحث] ** روابط مواقع اباحيه .. للكبار فقط .. - ملخصات وتقارير جاهزة للطباعة - قدمة ذات الورنية الوصف - الشروط الواجب توفرها للحصول على تأشيرة العمرة من السفارة السعودية بالمغرب - نهر إشيكاري الجغرافيا - قائمة حكايات ألف ليلة وليلة القائمة - هواتف إدارة شؤون المتقاعدين بالسعودية و معلومات عنها - عبد الرحمن قويدر عن حياته - [بحث جاهز للطباعة] مشروع تخرج علم اجتماع جاهز , مشاريع تخرج علم اجتماع - - جعفر الفاسي - طور السكون السكون في النبات - جواز سفر إثيوبي شروط جواز السفر الجديد - جهاز جولجي التكوين - [بحث جاهز للطباعة] خاتمة بحث ديني علمي عربي قصيره - - مولان (فيلم 1998) أسماء مؤدو اصوات الشخصيات - فوائد نبات الضرم او الخزامى من عيادة العلاج بالاعشاب والطب البديل - هاتف وعنوان شركة الملحم للغطاسات والمضخات - الهفوف, الاحساء - طريقة عمل (الحبش ) الديك الرومي من الشيف منال العالم - حيود الإلكترونات شروط حدوث الحيود - هاتف وعنوان مستوصف منار الطبي - بقيق, الدمام - باشوت الموقع الجغرافي والطقس - قائمة شخصيات ون بيس القراصنة - فحص سريري خطوات الفحص السريري - هاتف وعنوان مستشفى الأهلي السعودي - العزيزيه, مكة المكرمة - عزم مغناطيسي تعريف - طريقة تحضير المصابيب القصيمي بطريقة سهلة - معايرة (كيمياء) طريقة المعايرة - [بحث جاهز للطباعة] نموذج مقدمة بحث لغة عربية doc , نماذج بحوث عربية doc - - دائرة مقاومة ومكثف مقدمة - هواتف دار الملاحظة الاجتماعية بالدمام ومعلومات عنها بالسعودية - جاسم يعقوب حياته العائلية - هاتف وعنوان مطعم الشيباني - باب مكه, جدة - اسباب وجود ماء خلف الرحم - هاتف وعنوان مستشفى الملك عبد الله بن عبد العزيز - بيشه, عسير - قائمة أشهر المحسنين شخصيات بارزة في العمل التطوعي - [بحث جاهز للطباعة] مشروع تخرج محاسبة جاهزة doc , مشاريع تخرج محاسبة بكالوريوس - - ترياك بنية الترياك - طريقة عمل الشراغيف (اكله شعبيه - هاتف وعنوان مطاعم شواية الخليج - المجمع, الدمام - اختبار روكويل للصلادة الاختبار - حياتي عذاب (مسلسل) الـقـــصـــــة - سحلب ذكري وصف النبات - منخربات رتبة المنخربات - مبدأ جدانوف - تجربة فرانك-هرتز التجربة - الطندب اصل التسميه - علم الأنسجة أنواع الأنسجة - طريقة عمل سـاتي الدجـاج بطعم لذيذ لا تفوتك - قائمة مدن البحرين جميع مدن وقرى البحرين - العلاج الفعال لمرض جرثومة المعدة ونصائح طبية للمرضى - هاتف وعنوان محل العقيل للإطارات - بريده, القصيم - خلطة مجربة لعلاج تاخر الحمل وهرمون الحليب وتكيس المبايض - الطاهر قيقة من مؤلفاته - مبارك الميلي تعريف - همام بن مرة سيرته الذاتية - قبيلة الهزازي أقسام قبيلة الهزازي - تقلصات قوية أسفل البطن في الشهر الخامس من الحمل فما العلاج؟ - [بحث جاهز للطباعة] مشروع تخرج جاهز كامل , مشاريع تخرج جاهزة كاملة - - طريقة عمل وصفة بسكويت الينسون على طريقة منال العالم - طريقة تحضير شكلمة جوز الهند من الشيف منال العالم - شرشال أصل تسمية شرشال - جص الصيغة الكيميائية للجبس - هاتف وعنوان مطعم شواية الخليج - لاسلكي, الدمام - طريقة تحضير الخشخاش - حلوى تقليدية جزائرية بطريقة سهلة - أحياء الخرطوم بحري أهم الأحياء - ليونارد بلومفيلد نشأته ودراسته - هاتف وعنوان مستوصف التضامن الطبي - عريجا, مدينة الرياض - ميزانية و تكاليف ودراسة جدوى مشروع إنتاج عيش الغراب - عثمان خالد أبو جحجوح الروائي والأديب الفلسطيني / عثمان خالد أبو جحجوح (1951- ) - هاتف وعنوان محل بدر حنيتان بدر الحربي للاثاث - عقلة الصقور, القصيم - نظرية المدارات الجزيئية الاتصال بمخططات «MO» المدار الجزيئي والهندسة الجزيئية - طريقة عمل كبه مهبلة بالصور - [بحث] بطاقة قراءة لكتاب الدكتور فاروق أبوزيد بعنوان مدخل الى علم الصحافة - ملخصات وتقارير - هرقل (فيلم 1997) أسماء مؤدو اصوات الشخصيات - كوخ العم توم ملخص الرواية - الطب في مصر القديمة المراجع المصرية القديمة - طريقة تحضير الميرمية(أعشاب) بطريقة سهلة - أشيقر سكان وقبائل بلدة أشيقر - عبد المنعم الحفني من مؤلفاته - طاقم بحري أقسام أفراد الطاقم - هاتف وعنوان الكركند للمأكولات البحرية - خميس مشيط, عسير - مرشح ترددات منخفضة أمثلة على مرشحات الترددات المنخفضة - مستقبل الأستيل كولين التصنيف - طريقه معرفة نوع الجنين وترجيح المولود القادم بأذن الله - حي الندوه (الرياض) أهم الشوارع الرئيسية - ريفامبيسين الاستخدامات الطبية - برنامج دالتون المدارس - كربونات الباريوم الخواص - صباح الخير يا وطنا (أغنية) كلمات الأغنية - قائمة بمحطات توليد الطاقة في الجزائر محطات إنتاج الكهرباء بالغاز - هاتف وعنوان مستوصف الشفاء - خميس مشيط, عسير - هيئة الشؤون المالية للقوات المسلحة (مصر) رؤساء الهيئة - جون بولبي نظرية التعلق - معادلة بواسون الصياغة الرياضية - هاتف وعنوان جي ان سي ارمال - السلامه, جدة - قانون مالوس - قبيلة المشاييخ نسب المشاييخ - معاهدة دي ميشال مواد المعاهدة - قرية مشذوبه - شرح تفصيلي لإجراءات الحصول علي تأشيرة زيارة تجارية للسعودية - اختبار فيكرز للصلادة - هاتف وعنوان مستوصف المغلوث الطبي - المبرز, الاحساء - هاتف وعنوان اكاديمية البكاري الصحية - الحره الشرقيه, المدينة المنورة - علاء الدين (حكاية) ملخص الحكاية - تاشودة - هاتف وعنوان مستوصف الدوسري - بقيق, الدمام - العائلات الكيماوية القلائيات - معلومات هامة عن سلالة دجاج الفيومى - تولوين - طريقة عمل الميكاتو بطعم لذيذ - ميزانية و تكاليف ودراسة جدوى مشروع ثلاجات التخزين - طريقة تحضير حلى الرخام من كتاب النخبة بطريقة سهلة - مكونات أحيائية تأثيرات على البيئة - أرقام طوارئ الكهرباء بالمملكة العربية السعودية - هاتف وعنوان المستشفى السعودي الألماني ,عسير - خميس مشيط, عسير - تحليل وزني حراري جهاز التحليل - هضبة الدبدبة - تبييض الشعب المرجانية أسباب تبيض المرجان - آلان تورين السيرة الذاتية - بويراز كارايل (مسلسل) قصة المسلسل - هاتف وعنوان عيادة ايفا ( عناية حواء) - العليا, مدينة الرياض - سحلب (نبات) من أنواعه الواطنة في الوطن العربي - حيدوان - هواتف مؤسسة الزيمي للمقاولات العامة ومعلومات عنها بالسعودية - توصيل دلتا الفرق بين توصيل دلتا وتوصيل نجمة - هاتف وعنوان مؤسسة غسان للتجارة - عوالي, المدينة المنورة - هاتف مدرسة ابو اسماعيل الهروي ثانوي و معلومات عنها بمنطقة الرياض بالسعودية - قائمة مغنيات لبنانيات قائمة - تركيز رأسمالي تعريف - هبة عبوك أعمالها - تركيب نسيجي التراكيب النسيجية الرئيسية - [بحث جاهز للطباعة] أهم بحث طبي عن مرض فقر الدم الثلاسيميا - - منخفض الفيوم أصل المنخفض وتطور الأحداث فيه - نبيذ أنواع النبيذ - أولاد حريز أصل وتاريخ القبيلة - طريقة عمل النمورة وصفة رمضانية لذيذة من منال العالم -
اليوم: الثلاثاء 18 ديسمبر 2018 , الساعة: 10:59 م / اسعار صرف العملات ليوم الثلاثاء 18/12/2018


اعلانات
محرك البحث


لطخة ويسترن خطوات لطخة ويسترن

نشر قبل 2 سنة و 2 شهر 411 مشاهدة


اعلانات
شاركنا رأيك بالموضوع

خطوات لطخة ويسترن


تحضير الأنسجة



يمكن أخذ العينات من أنسجة كاملة أو من زراعة الخلايا. يتم كسر الأنسجة الصلبة ميكانيكيًا، في أغلب الأحيان، باستخدام خلاّط (لإحجام عينات كبيرة)، باستخدام مجنس homogenizer (للأحجام الأصغر)، أو الصوتنة بالصوتنة Sonication. يمكن كسر وفتح الخلايا بإحدى الطرق المذكورة أعلاه أيضًا.


يمكن توظيف العديد من المنظفات والأملاح والمحاليل لتشجيع التكسر الخلوي ولإذابة البروتينات. يتم أيضًا إضافة مثبطات (موانع) البروتييزات والفسفاتازات Protease and Phosphatase Inhibitors وذلك لمنع تآكل العينة بإنزيماتها الخاصة.


يتم استخدام مجموعة من التقنيات الميكانيكية والكيمياحيوية (البايوكيميائية) من ضمنها أيضًا العديد من أنواع التصفية و طرد مركزي الطرد المركزي لفصل أجزاء أو عضيات معينة من الخلايا.


image SDS-PAGE sample.png


الفصل الكهربائي للهلام


مفصلة فصل كهربائي للهلام


يتم فصل بروتينات العينة باستخدام فصل كهربائي الفصل الكهربائي . فصل البروتينات قد يكون باستخدام النقطة متوازنة الكهربة Isoelectric point (pI)، الوزن الجزيئي، الشحنة الكهربائية، أو مجموعة من هذه العوامل. طبيعة الفصل تعتمد على طريقة معالجة العينة وطبيعة الهلام.


إلى حد الآن، الطريقة الأكثر شيوعاً للفصل الكهربائي للهلام توظف هلامات متعدد الأكريلامايد polyacrylamide ومحاليل تحتوي على كبريتات دوديكل الصوديوم Sodium Dodecyl Sulfate (SDS).


SDS-PAGE أي (الفصل الكهربائي لهلام كبريتات دوديكل الصوديوم متعددالأكريلامايد SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis) تحافظ على سلسلة البروتيات في حالة مفككة denatured state حالماً يتم معالجتهم مع عوامل اختزال قوية للقضاء على الأشكال الثانوية والثالثية. (مثل تحويل الروابط ثنائية الكبريت S-S إلى SH و SH) وبذلك يسمح لفصل البروتينات حسب وزنهم الجزيئي. يتم تغطية البروتينات في العينة بكبريتات دوديكل الصوديوم السالبة الشحنة ونقلها إلى القطب الكهربائي الموجب الشحنة خلال شبكة الأكريلامايد في الهلام.

البروتينات الصغيرة تهاجر أسرع خلال هذه الشبكة وبذلك يتم فصل البروتينات حسب الحجم (عادة ما يتم قياسها بالكيلودالتون، kD، kiloDaltons). تركيز الأكريلامايد يحدد دقة الهلام - كلما زاد تركيز الأكريلامايد كلما زادت دقة البروتينات ذات الأوزان الجزيئية العالية. البروتينات تهاجر ببعد واحد خلال الهلام لأغلب اللطخات.

image SDS-PAGE Electrophoresis.png


WB-gel الهلام ويلاحظ فيه الدرج بصورة حزم زرقاء اللون بسبب الصبغة الزرقاء كوماسي بلو Coomassie Blue

يتم تحميل العينات في < >آبار في الهلام. يتم حفظ إحدي الأسطر للـ < >درج أو < >العلامات، وهما خليط متوفر تجارياً من عدة بروتينات معروفة الوزن الجزيئي، عادة ما تكون مصبوغة لكي تُظهر حزم ملونة مرئية.


أحد الأمثلة على الدرج، هو درج الأوزان الجزيئية الكامل المدى لشركة GE (كما في الشكل). عندما يتم تطبيق فرق الجهد على الهلام، تهاجر البروتينات ضمنه بسرع مختلفة. هذه المعدلات الزمنية المختلفة للتقدم ( حركة فصل كهربائي حركات الفصل الكهربائي المختلفة) تُفصل إلى < >حُزم ضم كل < >سطر.



من الممكن أيضاً استخدام هلام ثنائي الأبعاد الفصل الكهربائي ثنائي الأبعاد الذي يفصل البروتينات من عينة واحدة في بُعدين. البروتينات تفصل بحسب النقطة متوازنة الكهربة (تركيز أيونات الهيدروجين pH الذي تكون فيه الشحنة متعادلة) في البعد الأول، وبحسب الوزن الجزيئي في البعد الثاني.


النقل



من أجل جعل الوصول للبروتينات أسهل للاكتشاف بالأجسام المضادة، يتم نقلهم من الهلام إلى غشاء مصنوع من النيتروسيليوز أو الـPVDF. يتم وضع هذا الغشاء فوق الهلام، ووضع مجموعة من طبقات أوراق الترشيح فوق ذلك. ثم يتم وضع الطبقات كلها في محلول يقوم بالتنقل إلى الأعلى عبر الأوراق بالخاصية الشعرية Capillary action، جالباً البروتينات معه إلى الغشاء.


ومن الطرق الأخرى لنقل البروتينات تدعى اللطخة الكهربائية وتستخدم تياراً كهربائي لسحب البروتينات من الهلام إلى الغشاء.


البروتينات الآن نُقلت من داخل الهلام إلى سطح غشاء من النيتروسيليلوز أو PVDF مع ثباء الترتيب التي كانت البروتينات عليه داخل الهلام. ويكون ناتج هذه العملية، هو عرض البروتينات على سطح رقيق للاكتشاف (انظر أسفلاً). كلا نوعي الغشاء (نيتروسيليلوز أو PVDF) يتم اختيارهم لخاصية الالتصاق غير المحدد بالبروتيات (أي أنهم يلتصقون بأي بروتين بصورة متساوية). التصاق البروتينات مبني على تفاعلات مصابة بفوبيا الماء hydrophobic interactions)، بالإضافة إلى التفاعلات المشحونة بين الغشاء والبروتين. إن أغشية النيتروسيليلوز تكون أقل كلفة من الـ PVDF، ولكنهم هشة أكثر ولا تستطيع الوقوف لتحقيقات مجددة reprobes كثيرة.Renart J, Reiser J, Stark GR. Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera a method for studying antibody specificity and antigen structure , < >Proc  Natl  Acad  Sci  U  S  A, 1979 Jul 76(7) 3116-20. PMID   91164] [http //www.pnas.org/cgi/content/abstract/76/7/3116 abstract




image Western blot transfer.png


التأثير الكلّي والموحّد لنقل البروتين من الهلام إلى الغشاء يمكن التأكد منه بصبغ الغشاء بصبغة كوماسي Coomassie أو بونسو س Ponceau S. كوماسي هي الصبغة الأكثر حساسية من الصبغتين، بالرغم من أن سهولة ذوبان بونسو س في الماء تجعله أسهل للإزالة لاحقاً والتحقق من الغشاء كما في أدناه.
Towbin H, Staehelin T, Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets procedure and some applications < >Proc  Natl  Acad  Sci  U  S  A, 1979 Sep 76(9) 4350-4. PMID   388439] [http //www.pnas.org/cgi/content/abstract/76/9/4350 abstract




السد


بما أنه تم اختيار الغشاء لقابليته على الالتصاق بالبروتينات، وكلاً من الأجسام المضادة والأهداف هما بروتينات، يجب إتخاذ إجراءات خاصة لمنع التفاعلات بين الغشاء والجسم المضاد المستخدم لاكتشاف البروتين الهدف. يتم سد الالتصاق غير المحدد عن طريق وضع الغشاء في محلول مخفف من بروتين - عادة ما يكون هذا البروتين هو ألبومين مصل البقر Bovine Serum Albumin المعروف بالـ BSA أو حليب من غير دهون (كلاهما ليسا مكلفان)، مع مقدار صغير من منظف مثل توين 20 Tween. البروتين في المحلول المخفف يلتصق بالغشاء في كل الأماكن الغير محتوية على البروتينات الهدف. وبهذا، عندما يتم إضافة الجسم المضاد، لن يكون هناك مكان له ليلتصق غير على مواقع الالتصاق على البروتين الهدف المحدد. هذا يقلل التشويش في النتيجة النهائية للطخة ويسترن، ويؤدي إلى نتائج أوضح، ويقضي على النتائج الإيجابية المزيفة.


الاكتشاف


خلال عملية الاكتشاف، يتم التحقق من وجود البروتين المطلوب على الغشاء عن طريق جسم مضاد معدل مرتبط بإنزيم مراسل، الذي عند وضع مادة معينة عليه يسبب تفاعل لوني ويقوم بإنتاج لون معين. ولعدة أسباب، فإن هذه الخطوة تتم بخطوتين، بالرغم من أن الآن يوجد طرق اكتشاف ذات خطوة واحدة لبعض الاستخدامات.


الخطوتين


  • الجسم المضاد الأولي


  • يتم تكوين الأجسام المضادة عندما يتم عرض البروتين المطلوب (أو جزءاً منه) على المستضيف أو خلايا المناعة المزروعة. عادةً، يكون هذا جزءاً من الاستجابة المناعية، ولكن هنا يتم حصد الأجسام المضادة واستخدامها كأدوات اكتشاف دقيقة وحساسة تلتصق بالبروتين مباشرة.


    بعد عملية السد، يتم احتضان الغشاء في محلول مخفف من الجسم المضاد الأولي (عادة بتركيز بين 0,5 ميكروغرام /مل إلى 5 ميكروغرام/مل) مع التحريك الخفيف. بشكله النموذجي، يحتوي المحلول على محاليل ملحية مع نسبة صغيرة من المنظفات، وأحياناً مسحوق حليب أو ألبومين مصل البقر BSA. يمكن وضع محلول الجسم المضاد والغشاء معاً واحتضانهما لأي فترة بين 30 دقيقة إلى عبر الليل. ويمكن أيضاً احتضانهما في درجات حرارة مختلفة، حيث تكون الدرجات الدافئة أكثر محفزة على الالتصاق (لكلا نوعي الالتصاق، الالتصاق المحدد والالتصاق الغير محدد التشويش ).


  • الجسم المضاد الثانوي


  • بعد تنقيع الغشاء أو غسله لإزالة الأجسام المضادة الأولية الغير ملتصقة، يتم إضافة جسم مضاد آخر للغشاء، موجه نحو جزء خاص-لنوع species-specific الجسم المضاد الأولي. وهذا يعرف بالجسم المضاد الثانوي، وبسبب خواصه المستهدِفة، يتم تسميته بـ ضد-الفأر ، ضد-العنز ، ضد-الجرذ ، الخ. الأجسام المضادة تأتي من مصادر الحيوانات (أو زراعة خلايا هيبريدوما حيوانية)؛ فالجسم المضاد الثانوي ضد-الفأر سيلتصق لأي جسم مضاد أولي مصدره الفأر. وهذا يسمح لتوفير المصاريف بالسماح لكل المختبر من استخدام مصدر واحد من جسم مضاد منتج بكثرة، ويوفر نتائج منسقة أكثر بكثير. عادة ما يكون الجسم المضاد الثانوي مرتبط بجزيئة بايوتين أو إلى إنزيم مراسل مثل فسفاتاز قلوي Alkaline phosphatase أو بيروكسيداز الفجل الحار Horseradish peroxidase. هذا يعني أن عدة أجسام مضادة ثانوية ستلتصق بجسم مضاد أولي واحد وتقوم بتعزيز الإشارة للاكتشاف.

    image Western Blot binding.png


    غالباً ما يتم استخدام جسم مضاد ثانوي مرتبط ب بيروكسيداز الفجل مع عامل مضيء كيميائي، وينتج التفاعل بينهما ضوءاً بمقدار كمية البروتين. يتم استخدام طبقة حساسة من الفيلم الفوتوغرافي لخلق صورة للأجسام المضادة الملتصقة باللطخة.


    كما في إجراءات إيلايزا الإيلايزا إيلايزبوت الإيلايزبوت ، يمكن تزويد الأنزيم بجزيئة التي يحولها الإنزيم إلى ناتج تفاعل ملون يمكن رؤيته على الغشاء.


    البديل الثالث هو استخدام علامة مشعة بدل إنزيم متصل بالجسم المضاد الثانوي، مثل ربط بروتين يلتصق بالأجسام المضادة (مثل بروتين أ من العنقودية Staphylococcus) نظير بنظير مشع من يود اليود . ولكن بما أنه الطرق الأخرى هي أكثر أماناً، وأسرع وأرخص، قلّ ما يتم استخدام هذه الطريقة الآن.


    الخطوة الواحدة


    تأريخياً، كانت عملية التحقق تُجرى بخطوتين وذلك بسبب السهولة النسبية لإنتاج أجسام مضادة أولية وثانوية من ناحية المرونة، وأيضاً يضيف خطوة تكبير للإشارة لعملية الاكتشاف.


    نظراً للقدرة الإنتاجية العالية لتحليل البروتينات وانخفاض حدود الإشارة المطلوبة للكشف، تم تطوير طرق تحقُّق ذات خطوة واحدة والتي تستطيع أن تحدث بصورة أسرع مع تقليل استخدام المستهلكات. وهذا يتطلب جسم مضاد ملتقط الذي يتعرف على البروتين المطلوب ويحتوي على علامات اكتشاف/التقاط، وغالباً ما يكون هناك ملتقطات بروتينات مؤشرة للبروتينات المؤشرة Protein tags. يتم احتضان الملتقط الأولي مع الغشاء بطريقة مشابهة للجسم المضاد الأولي في طريقة الخطوتين، ومن ثم يكون جاهز للكشف بعد سلسلة من خطوات الغسل.


    Blotautoradiogram.png frame لطخة ويسترن باستخدام طريقة الاكتشاف المشع


    التحليل


    بعد أن يتم غسل الملتقطات الغير ملتصقة، تصبح لطخة ويسترن جاهزة للاكتشاف عن طريق الملتقطات الملتصقة بالبروتين المراد اكتشاف وجوده أو عدمه. في المصطلحات العملية، لا تُظهر كل لطخات ويسترن البروتين بصورة حزمة واحدة فقط على الغشاء.

    يتم أخذ تقديرات الحجم عن طريق مقارنة الحزم المكتشفة بحزم الدرج المصبوغة التي تم تحميلها عند خطوة الفصل الكهربائي. يتم إعادة هذه العملية لبروتين هيكلي، مثل الأكتين أو التيوبيولين، الذي لا يجب تغيير تركيزه بين العينات. كمية البروتين الموجودة تتم مقارنتها بالبروتين الهيكلي لكي يتم السيطرة على المجموعات العدة. هذه الطريقة تؤكد تصحيح التغييرات الدارجة بسبب عدم انتقال البروتين أو وجود أخطاء في التجربة.


    الاكتشاف اللوني Colorimetric detection


    طريقة الاكتشاف اللوني تعتمد على احتضان لطخة ويسترن مع المادة التي ستتفاعل مع الإنزيم المراسل (مثل بيروكسيداز البيروكسيداز Peroxidase) الذي يكون مرتبط بالجسم المضاد الثانوي. هذا يحول الصبغة الذائبة إلى شكل غير ذائب بلون مختلف والتي تترسب قرب الإنزيم وبالتالي تصبغ غشاء النيتروسيليلوز. يتم إيقاف تحميض اللطخة عندها عن طريق غسل الصبغة الذائبة. يتم تحليل كمية البروتينات باستخدام قياس الكثافة densitometry (أي ما هي كثافة البقعة/الصبغة) أو قياس الضوء spectrophotometry.


    الإضاءة الكيميائية Ch iluminescence




    تعتمد طريقة الاكتشاف بالإضاءة الكيميائية على احتضان لطخة ويسترن مع المادة التي تضيء عندما تتصل بالجزيء المراسل على الجسم المضاد الثانوي. وعندها يتم التقاط الضوء باستخدام فيلم فوتوغرافي ، ومؤخراً باستخدام كاميرات سي سي دي CCD cameras تلتقط صورة رقمية للطخة ويسترن. هذه الصورة يتم تحليلها باستخدام مقياس الكثافة الذي يحلل كمية الصبغة البروتينية النسبية ويقوم بالتحليل الكمي عن طريق الكثافة الضوئية. يوجد برامج جديدة تساعد على تحليلات البيانات بصورة أخرى مثل تحليل الوزن الجزيئي إذا تم استخدام مقاييس صحيحة. يعتبر ما يسمى ب المضيء الكيميائي المحسن Enhanced ch iluminscent أو ECL هو من ضمن أكثر الطرق حساسية للاكتشاف التحليلي للطخة ويسترن.


    image Western blot ch iluminescent detection.png



    الاكتشاف المشع Radioactive detection


    العلامات المشعة لا تحتاج إلى مواد إنزيمية، ولكن فقط وضع أفلام أشعة سينية طبية مباشرة على لطخة ويسترن والذي يقوم بخلق أجزاء غامقة على الفيلم تعود إلى حزم البروتينات المطلوب كشفها (انظر الصورة). قلت أهمية طرق الاكتشاف المشع، بسبب كونها مكلفة، ولها أخطار صحية عالية، كما أن المضيء الكيميائي المحسن ECL يعتبر بدل مفيد جداً.


    الاكتشاف الفلوري Fluorescent detection


    يتم تحفيز الملتقط ذو العلامات الفلورية بواسطة الضوء والانبعاث من التحفيز وبذلك يتم الاستدلال عليه بواسطة متحسس ضوئي مثل كاميرا سي سي دي المزودة بمرشح باعث مناسب حيث يقوم بألتقاط الصورة الرقمية للطخة ويسترن ويقوم بالسماح لتحليل بيانات أخرى كالوزن الجزيئي والتحليل الكمي للطخة ويسترن. يعتبر الملتقط الفلوري من بين أكثر الطُرق حساسية لتحليل اللطخة.


    التحقق الثانوي


    أحد الاختلافات الكبيرة بين غشائي النيتروسيليلوز و PVDF يعود إلى قابلية كل منهم على القيام بـ تعرية للأجسام المضادة وإعادة الاستخدام لأجسام مضادة ملتقطة لاحقاً. وبالرغم من أن هناك طرق مختبرة لتعرية أغشية النيتروسيليلوز، تظل أغشية الـPVDF أسهل تعرية، وتسهل استخدام أكثر قبل أن يقوم التشويش الخلفي بإعاقة التجارب. أحد الاختلافات الأخرى هو، بعكس النيتروسيليلوز، الـPVDF يجب أن ينقع في 95 إيثانول، بروبانول أو ميثانول قبل الاستخدام. أغشية الـPVDF أيضاً تكون أكثر سمكاً وأكثر مقاومة للضرر خلال الاستخدام.


    الفصل الكهربائي للهلام ببعدين


    2D-SDS-PAGE ثنائي الأبعاد يستعمل المبادئ والتقنيات المُشار إليها اعلاه. كما يشير الاسم، فإن هذه الطريقة تشمل هجرة سلسلة البروتينات في بعدين. في البُعد الأول تقوم السلسلة البروتينية بالأنفصال حسب نقطة التعادل الكهربي. أما في البعد الثاني تنفصل السلسلة البروتينية حسب وزنها الجزيئي. تُقاس نقطة التعادل الكهربي لبروتين مُعين بواسطة الرقم النسبي للأحماض الأمينية الموجبة (ك لايسين اللايسين ) والسالبة (ك جلوتاميت الجلوتاميت ), وتقوم الأحماض الأمينية السالبة بتزويد أعلى نقطة تعادل كهربي, ومن جهة أخرى تقوم الأحماض الامينية الموجبة بتزويد أقل نقطة تعادل كهربي.


    تسمح هذه الطريقة بفصل كل البروتينات الخلوية على هلام مفرد وكبير. من الفوائد المهمة لهذه الطريقة هي التمييز بين الأشكال المُختلفة لبروتين مُعين (مثلاَ البروتين الذي تمت فسفرتهُ، أي إضافة المجموعة السالبة الشُحنة). يُمكن قطع البروتين الذي تم فَصله من الهُلام وبعدها يتم تحليله بواسطة جهاز تحليل الكتلة mass spectrometry الذي يقوم باكتشاف البروتين وتحديد هويته.


    الاستخدامات في الفحص الطبي




    الطرق


  • طريقة مختبر الدكتور مارك بارتون فرانك


  • Western Blot.png تصغير لطخة ويسترن

    في تقانة حيوية التقنيات الحيوية ، لطخة ويسترن إنج Western Blot (تعرف أيضا باللطخة المناعية Immunoblot) هي طريقة اكتشاف بروتين معين في عينة أو مستخلص أنسجة، وهي من التقنيات الحيوية المخبرية. تستخدم الفصل الكهربائي للهلام لفصل البروتينات الطبيعية native proteins أو بروتين مفكك البروتينات المُتَمَسِّخة denatured proteins حسب طول السلاسل البروتينية (ظروف مفككة) أو حسب الشكل الثلاثي الأبعاد للبروتين (ظروف قومية/غير مفككة). يتم، في ما بعد، نقل البروتينات إلى غشاء (عادة ما يكون الغشاء مصنوعا من مادة نيتروسيليلوز النيتروسيليلوز أو PVDF )، حيث يتم التحقق (الاكتشاف) باستخدام أضداد مخصصة للبروتين الهدف. هناك الآن العديد من شركات المواد التي تتخصص في تجهيز أضداد (مستنسخة ومتعددة النسائل) ضد آلاف البروتينات المختلفة. وقد قام هذا بتقليل الوقت الذي تحتاجه لعمل لطخة بصورة كبيرة.



    كان يجب، سابقًا، تلقيح الحيوانات الكبيرة (مثل خروف الخرفان ، عنز العنز - يحتويان على الكثير من مصل المصل ) بالبروتين المستهدف مرتين (حيث أن الاستجابة المناعية الثانية تنتج أضدادا أكثر). ومن ثم إما يتم تصفية المصل واستخدامه (أضداد متعددة النسائل - Polyclonal -) أو يمكن فصل الخلايا البائية من الحيوان ودمجها خارج الجسم < >in vitro مع خلايا فأر سرطان سرطانية لتوليد خلايا هيبريدوما التي تستطيع في ما بعد إنتاج أضداد وحيدة النسيلة (Monoclonal).



    الأضداد التجارية عادة ما تكون مكلفة، ولكن يمكن إعادة استخدامها (استخدام ما يتبقى من الأجسام المضادة غير الملتصقة) بين التجارب. هذه الطريقة تستخدم في الأحياء الجزيئية ، الكيمياء الحيوية ، و علم الجينات المناعية Immunogenetics وعدة أخرى من علوم الأحياء الجزيئية.


    من التقنيات الأخرى المتعلقة هي استخدام الأجسام المضادة لاكتشاف البروتينات في الأنسجة أو الخلايا باستخدام صبغة مناعية الصبغة المناعية Immunostaining و إلايزا الإلايزا ELISA.


    تم صنع هذه الطريقة في مختبر جورج ستارك في جامعة ستانفورد عام 1981. قام وولتر نيل بورنيت بتسميتها باسم لطخة ويسترن ، Cite journal
    author W. Neal Burnette

    'Western blotting' electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate — polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A

    journal Anal Bioch


    year 1981

    month April

    volume 112

    issue 2

    pages 195-203



    PMID   6266278] [http //dx.doi.org/10.1016/0003-2697(81)90281-5 doi 10.1016/0003-2697(81)90281-5
    Citation's Classic Burnette



    وهو مشتق من اسم لطخة جنوبية اللطخة الجنوبية (Southern Blot لغة إنكليزية بالإنكليزية ، من Southern وهي نسبة إلى إدون ساذرن Edwin Southern، والتي تعني أيضا الجنوبي لغة إنكليزية بالإنكليزية . فسميت التقنية الجديدة بـويسترن، تلاعبا بالمعنى). و لطخة جنوبية اللطخة الجنوبية تقنية لاكتشاف حمن الحمض الريبي النووي منقوص الأكسجين DNA، قام إدون ساذرن Edwin Southern بصنعها عام 1975. تسمى طريقة اكتشاف حرن الحمض الريبي النووي RNA باسم لطخة شمالية اللطخة الشمالية .

     
    التعليقات (1 تعليق)

    (اضيف قبل 1 سنة و 5 شهر)
    تبليغ عن اساءة

    انسخ الارقام تحتهم


    زائر     طلب حذف التعليق
    مفيد جداً
     


    اعلانات
    تصنيفات الموقع
    شاهد الجديد لهذه المواقع
    بئر السبع ميسوكسيمايد تل هشومير المرجة الزرقاء أسامة بن زيد الغاف خطة عمل روبرك الطاقة الداخلية مذكرات دورية نحو الشرق ايو جيما العياضي برباس العياضي شركة مكافحة حشرات خوارزمية ديكسترا مرفأ بيروت الكايد طاش ما طاش شركة كايد البسقلون كورونا سد حراض الفن البيزنطي عبد السلام بنعبد العالي رائد عودة مستشفى طيبة التخصصي غزوة خيبر شركة فواز لعامة للدراسات والمستندات كلوفيس الأول لمع قطع الغيار جميل خطاب ويلان نظم المعلومات المحاسبية محمود بن محمود البان باقادر مؤسسة بن شيهون الصحة الحقن المجهري الصين معلمات معلومات اتجاه البطولي أرضروم تنافسية شكاوي محمد الحاج سالم تكرلي مبرهنة عدم الاكتمال علاج عرق النسا موقع سنهدريم التكامل العددي كهربا الحكومة الحكومة التونسية مسالك بولية معاهدة فاليتا مستشفي بدر مشاغل مراكز التجميل محمد حافظ الشريدة وديع سعادة مشغل جرافيزم شكا الربان حديقة التجارة نقليات الهباس بن دعجم بطباط حمود بوعلام حميدة معركة ثابسوس براتا البن الاخضر مشروع تخرج الزكاه ديدفورت تاريخ فواصل الكتب توسعة المسجد النبوي نادي الفتح telnet 1978 عصبام اللوزتين سبيكمان 213 الاقتصاد رمادي عادي فندق العليا تشويه سمعه اسماك الأسماك مؤسسة الجهاز القلبي الوعائي
    أخبار السعودية اليوم الثلاثاء 18/12/2018 - أخبار قطر اليوم الثلاثاء 18/12/2018 - أخبار الإمارات اليوم الثلاثاء 18/12/2018 - أخبار الكويت اليوم الثلاثاء 18/12/2018 - أخبار السياحة اليوم الثلاثاء 18/12/2018 - أخبار البحرين اليوم الثلاثاء 18/12/2018 - أخبار المغرب اليوم الثلاثاء 18/12/2018 - أخبار الاردن اليوم الثلاثاء 18/12/2018 - أخبار فلسطين اليوم الثلاثاء 18/12/2018 - أخبار عمان اليوم الثلاثاء 18/12/2018 - أخبار لبنان اليوم الثلاثاء 18/12/2018 - أخبار السودان اليوم الثلاثاء 18/12/2018 - أخبار الكورة اليوم الثلاثاء 18/12/2018 - اعلانات الحراج اليوم الثلاثاء 18/12/2018 - اسعار السيارات بالكويت الثلاثاء 18/12/2018 - اسعار العقارات بالكويت الثلاثاء 18/12/2018