موقع الو ساعد - الشيخ ابو مهند - نجارعبدالقيوم - أبــوعـصــمــت - هاشم خيرات طبيب شعبي يكوي - دسعد الشهري - سلامات - Vip - شاي ساره العجمي للتنحيف - أشرف نهضة أبوظبي - مكتب الزومان معتز - دكتور حسن قطب - فطاير جبد - منصور المواش - بقاله توصيل بكبد - المحامي/ وائل الغانمي - فنجال الشيباني ابو سلطان - مها الرشيدي 7 - مكتب بوقذيلة للعقارات - د.فراس العجمي - دكتور أعشاب اردني - م علي ابراهيم مغلس - مهندس حسن - حسام العرضيه مطعم برجر - محمد السنان بيت التمويل التركي - سعاده المستشار مبارك سعيد مبارك عباد - سعيود - Soud Alhajry - كريمهـ الطباخه - صالون بتر فلاي - بوبيان ادم خياط عسكري - فيصل القحطاني امنيه58 - كراج المساعيد - د.رشاد قشقري.ابن سينا - Msa3ed - محامي احمد المرباطي - دكتور اسماعيل الحراكي - محامي شيكات /اسماعيل الصيدلاني - الشيخ احمد الورقان - د. كايد احمد كايد - Khalti Maisa - د حاتم مطر نساء ولادة - كبب بيتنا اللذيذه ب11 ونص - فطيرتي سوق الجليب - حسام ابو حادي - مستوصف نبع الحنان سكاكا - وتساب البنك الوطني - المحامي/ حسان دحلان - دكتور باسل جنيد - يوسف الشويحاني مشرف تد حائل -
الجديد مستودعات ثلاجات مبردة مجمدة للتقبيل - شركة القُصير السعودية لتأجير وبيع الخيـام الأوروبية ومولدات الكهرباء - الصلاة الصلاة - كيف ازرع النعناع في المنزل ؟ - فوائد التمر والحليب - كيف توفر العديد من المال على نفسك ؟ - كيف تبداء بمشروع صغير وناجح ؟ - كيف تصبح غنياً ؟ -
آخر المشاهدات جيما دريوسي أعمالها - سمك البغروس - هاتف وعنوان مستوصف العائلة الصحي - ابها, مدينة ابها - بطنج أسماؤه واستعمالاته - مذبحة ثانوية كولومباين - خلية جلفانية وصف الخلية الجلفانية - مبنى بلدية لندن - هواتف مؤسسة الأمجاد الكبرى ومعلومات عنها بالسعودية - تجلط الدم المراحل الفسيولوجية لتجلط الدم - النقبي اصول القبيلة وسبب التسمية - أياد راضي السيرة الذاتية - [بحث جاهز للطباعة] ملخص علوم اول متوسط مطور الفصل الدراسي الثاني - - أحمد (شاي) قصة شاي أحمد http //www.ahmadtea.com/our-story/ - كلية ابن سينا رسوم الكلية - فوائد الليمون والثوم فى علاج ديدان المعدة - قائمة الحاصلين على جائزة نوبل في الطب القائمة - وصفة لعلاج الربو و حساسية الصدر بالاعشاب الطبيعية - أفكار و طرق ترويجية لاجتذاب العملاء - ملالا يوسفزي حياتها - وصفة لعلاج التهاب المفاصل و آلام العضلات بخلطات الاعشاب - وصفات تعمل بالمنزل - سحر جوليا (مسلسل) ملخص القصة - هواتف مكتب المهندس نزار كردي و معلومات عنه بالسعودية - نورة بنت زايد الحابوط - دليل أسلوب شيكاغو - معركة حمض - نور خراط عن حياته - هواتف و معلومات عن جوازات مطار الملك عبد العزيز بالسعودية - أدولف لوس أشهر اعماله - وديع بائع الحليب قصة المسلسل - شمس الدين سامي فراشري آثاره - معلومات صادمه عن اكل التفاح ؟ - عيسى بن صالح الطائي عيسى بن صالح الطائي - هاتف وعنوان مستوصف سلامتك - حي النهضة, مدينة الرياض - محافظة الحناكية الموقع - عرعر (شجر) أنواع العرعر - هواتف مكتب الضمان الاجتماعى بحائل ومعلومات عنها بالسعودية - قلب الظلام ملخص الرواية - هواتف شركة رواد الجزيرة للتجارة والمقاولات القابضة ومعلومات عنها بالسعودية - شروط نقل ملكية المؤسسات بالتنازل أو البيع بالسعودية - كلوريد الحديد الثنائي الخواص - بانشي (مسلسل) القصة - اسئلة تدور فى ذهن كل حامل - هضبة حضرموت سطح الهضبة - الخليوي نبذة عن عائلة الخليوي - طريقة طبخ العتر من المطبخ اليمني بطعم لذيذ لا تفوتك - هاتف وعنوان مستشفى الملك فهد الجامعي - الخبر شمال, مدينة الخبر - غونغ هيو جن - هاتف وعنوان مستوصف الحمد الطبي - سكاكا, الجوف - هاتف وعنوان مطعم كتكوت - الهفوف, الاحساء - الجامعة الوطنية - السودان كليات الجامعة - حمض أكسجيني - قبيلة الهزازي أقسام قبيلة الهزازي - اعشاب لحرق الدهون فى الجسم للتخسيس و النحافه - بئر العزلة (رواية) نبذة عن أعمال رادكليف هول - وصفة هائلة من الطب البديل لعلاج امراض القدم والارجل بالاعشاب - خطوط الولايات المتحدة الجوية الرحلة 1549 الرحلة - جبال تيبستي - جامع أبو عابد تاريخه - [بحث جاهز للطباعة] مخاطر الاستعمال المفرط للاسمدة ، واكثار السلالات المرغوبة . - - عصفور الدوري الزقزاق الوصف - طريقة تحضير الميرمية(أعشاب) بطريقة سهلة - - دراسة مفصلة لمشروع انتاج وصناعة بخور العود - هاتف وعنوان محل قلعة الصخور للأحجار الكريمة - الصفا, جدة - جامعة ماليزيا بهنغ تاريح الجامعة - صور عالية الجودة لبرج خليفة بدبى اطول بناء في العالم - هاتف وعنوان المؤسسة التجارية للمصاعد - خميس مشيط, عسير - المسلة الناقصة وقت حفرها - محمد جار الله السهلي حياته - إقليم تيزنيت التقسيم الإداري - قطر (هندسة) رمز القطر - هاتف وعنوان مستوصف الحكمة الطبي - قاره, الجوف - عدد أنواع الأعداد - طريقة عمل غرزة النباته - [بحث جاهز للطباعة] بحث حول علم الكيمياء , كل ما يخص الكيمياء - - نوتان - هاتف وعنوان مستوصف المغلوث الطبي - المبرز, الاحساء - وصفة هائلة من الطب البديل لعلاج النحافه و فقر الدم وضعف الجسم بالاعشاب - الرجل في القلعة العالية - شعر حميني تعريف الشعر الحميني - أعزاز الموقع الجغرافي - دبا الحصن (مدينة) تـاريـخ دبا - قبيلة عنس نبذة تاريخية - طريقة عمل رز بالتونة يجنن بطعم لذيذ لا تفوتك - ميزانية و تكاليف ودراسة جدوى مشروع إنتاج أحذية جلدية للتصدير - حركة الفنون والحرف الخصائص - وصفة لعلاج سلس البراز بالاعشاب الطبيعية - أحياء الخرطوم بحري أهم الأحياء - هاتف و عنوان السفارة السعودية في مسقط و معلومات عنها - إيل كابو دي كابي - غرواني تصنيف الغرويات - باكلوفين الاستعمال الطبي - جامعة تشمران الأهوازية الكليات - طريقة عمل المعدس اكله كويتيه معروفه لا تفوتك - نادي القيصومة السعودي تشكيلة الفريق الحالية - برج الراديو وارسو (بولندا) - وصفة طبيعية من الطب البديل لعلاج قرحة المعدة وحموضة المعده بالاعشاب - ورم غدي متعدد الأشكال الحالة السريرية - صلاح الضللي - هواتف و عناوين مكتب الخطوط الجويه العربيه السعوديه في جاكرتا - محارب الجبوري - لانثانيدات الخواص الكيميائية - إنزيم نازع لهيدروجين اللاكتات النظائر - طريقة عمل كرات اللحم بالصلصة اشهى وصفات رمضان من منال العالم - جرمانيا عاصمة العالم - قناة الشرقية الشرقية نيوز - هاتف وعنوان مستوصف عالم الطب - الملز, مدينة الرياض - كيف تبداء بمشروع صغير وناجح ؟ - ديسيبل ميلي واط تحويل الوحدة - عنوان و هواتف القنصلية السعودية فى لوس أنجلوس ومعلومات شاملة عنها - معاني \" أو \" في اللغة العربية معاني أو العاطفة في اللغة العربية - فحص سريري خطوات الفحص السريري - اشرف سيد احمد الكاردينال مولده ونشاته - أوستنيت تآصل التآصل في الحديد - عمر بن حفصون نشأته - ما هو الشق الحنجري؟ - الثعلب (فيلم) - [مواضيع صحية] مستوصفات جدة لفحص العمالة , مستوصف فحص العمالة الوافدة بجدة - طب بديل وطب عام - الجمعية العربية للصحة الجنسية الاهداف - دراسة جدوى مفصلة لمشروع مصنع إنتاج جوارب - زلزال شانشي عام 1556 الزلزال - [بحث] أماكن سياحية وأثرية في الأردن - ملخصات وتقارير - ورم أرومي مينائي الأنواع الفرعية - ماتياس شونارتس المسيرة الفنية - إدارة الإشارة بالقوات المسلحة (مصر) مديري الإدارة - [بحث جاهز للطباعة] قائمة بعناوين مشاريع التخرج لتخصص التربية الاسلامية - - [بحث جاهز للطباعة] بحث عن اللغة العربية والكفايات اللغويه - - إخلاص المسباح من أهم الأعمال - تقرير عن نقاء تطلق حملة (حياتى احلى بلا تدخين) - منوعات مفيدة - هواتف مكتب الضمان الاجتماعى بالقطيف ومعلومات عنها بالسعودية - طريقة عمل بتر تشكين من منال العالم - وادي الذئاب (مسلسل) البث - طريقة عمل شوربة القرع مثل المطاعم بدقائق - وصفات الشوربات - قبيلة آل مرة أماكن وتوزيع القبيلة - هيبوكلوريت الكالسيوم الخواص - هاتف ومعلومات عن شركة تكسي للمطاعم والاغذية بالرياض - هالزي (مغنية) حياتها - هاتف وعنوان مصنع فلاتر المطلق - النزله, جدة - نساء حائرات (مسلسل) القصة - تعيين المحتوى المائى للتربة الهدف من التجربة - حدسية غولدباخ تاريخ - [بحث] التربية البدنية مع عليوش إبراهيم - ملخصات وتقارير - [مواضيع صحية] افضل دكتور اطفال في جدة , أفضل طبيب اطفال بجدة - طب بديل وطب عام - طريقة عمل الفراخ بالكاري ( الشيف حسن ) - ضربة القدر (فيلم) - هاتف و معلومات عن بلدية قرية العليا بالمملكة العربية السعودية - الالتهاب المياليني للعصب البصري الأعراض - محاولة انقلاب 1955 في السعودية - هاتف وعنوان مطعم ومعجنات شمس - بقيق, الدمام - تصوير بالرنين المغناطيسي تاريخ الرنين المغناطيسي - هواتف شركة النعيم للمقاولات المحدودة ومعلومات عنها بالسعودية - عبد الله بن يوسف الوابل نسبه - نيميو هاروكاوا - دون كيهوتي دوفلامنجو البطاقة الشخصية - أنس الله التسمية - الظفير التاريخ - عنوان و هواتف سفارة السعودية فى جمهورية باكستان الاسلامية ومعلومات شاملة عنها - غاز مثالي مواصفات الغاز المثالي - [بحث جاهز للطباعة] نموذج مقدمة بحث ادبي , نماذج بحوث ادبية - - وصفة هائلة من الطب البديل لعلاج مشاكل الدوره الشهرية و الحيض بالاعشاب - سيتي فيل - بسام جرار النشأة - طريقة تحضير كيكة الدخن بدون بيض بالذ طعم خطوة بخطوة - كيف تصبح غنياً ؟ - زيليتول الانتاج - طريقة عمل وصفة سندويش ستيك فيلادلفيا الشهية - روز كوارتز كوارتز كريستال Crystal Quartz  - أنبوب جايجر-مولر وصفها وطريقة عمها - غابة النصر - هواتف مؤسسة ميرال العربية للمقاولات ومعلومات عنها بالسعودية - جائزة برافو سجل الأبطال - عرض مميز : شاحنه مان 28.530 موديل 2004 رقم العرض 102642 بسعر جيد - سحر الغجريات (مسلسل) المزيد - هاتف وعنوان مستوصف المدلوح - سيهات, الدمام - بوسند في باريس (مسرحية) فريق العمل - القراغول - وصفة هائلة من الطب البديل لعلاج النتؤات او الثؤلول او الثلول بالاعشاب - طريقة عمل اليالنجي" وصفة شهية من المطبخ السوري بطعم لذيذ لا تفوتك - توزيع ماكسويل-بولتزمان تطبيقات عملية لتوزيع ماكسويل-بولتزمان - ورم غدي التغيرات النسيجية المرضية - اتفاقيتا لاهاي 1899 و1907 اتفاقية لاهاي 1899 - عبد المعز شاكر نشاته ودراسته - نبذة عن معركة حمض (1920 م ) فى الدفاع عن اراضي الكويت الغالية - [بحث] عالم البحار فى مجلة الابتسامة مع ارييج - ملخصات وتقارير - دواء ستريزام - قائمة مصطلحات تشريح العضلات (طب) التصنيف - ترنجان مخزني تسميات - معامل تردد التصادم - الجحدلي اسمها - اتفاقية كيب تاون التوقيعات والتصديقات - مرض بيروني العلاج الدوائي لمرض بيروني - انفكاك الأظفار onycholysis - كلية التقنيات الصحية والطبية في بغداد نبذة عن الكلية - هاتف وعنوان مستشفى الملك فهد - ابو عريش, جازان - فوائد نبات المقل من عيادة العلاج بالاعشاب والطب البديل - فريد إلياس الخازن - فوائد نبات شرش الزلوع أو النبتة الجنسية من عيادة العلاج بالاعشاب والطب البديل - وصفة هائلة من الطب البديل لعلاج الروماتيزم أمراض العظام والمفاصل بالاعشاب - هاتف وعنوان مستوصف العزيزية الطبي - مشرفه, جدة - يونس الغازولي -
اليوم: الاحد 24 فبراير 2019 , الساعة: 6:45 ص / اسعار صرف العملات ليوم الاحد 24/02/2019


اعلانات
محرك البحث


لطخة ويسترن خطوات لطخة ويسترن

نشر قبل 2 سنة و 5 شهر 463 مشاهدة


اعلانات
شاركنا رأيك بالموضوع

خطوات لطخة ويسترن


تحضير الأنسجة



يمكن أخذ العينات من أنسجة كاملة أو من زراعة الخلايا. يتم كسر الأنسجة الصلبة ميكانيكيًا، في أغلب الأحيان، باستخدام خلاّط (لإحجام عينات كبيرة)، باستخدام مجنس homogenizer (للأحجام الأصغر)، أو الصوتنة بالصوتنة Sonication. يمكن كسر وفتح الخلايا بإحدى الطرق المذكورة أعلاه أيضًا.


يمكن توظيف العديد من المنظفات والأملاح والمحاليل لتشجيع التكسر الخلوي ولإذابة البروتينات. يتم أيضًا إضافة مثبطات (موانع) البروتييزات والفسفاتازات Protease and Phosphatase Inhibitors وذلك لمنع تآكل العينة بإنزيماتها الخاصة.


يتم استخدام مجموعة من التقنيات الميكانيكية والكيمياحيوية (البايوكيميائية) من ضمنها أيضًا العديد من أنواع التصفية و طرد مركزي الطرد المركزي لفصل أجزاء أو عضيات معينة من الخلايا.


image SDS-PAGE sample.png


الفصل الكهربائي للهلام


مفصلة فصل كهربائي للهلام


يتم فصل بروتينات العينة باستخدام فصل كهربائي الفصل الكهربائي . فصل البروتينات قد يكون باستخدام النقطة متوازنة الكهربة Isoelectric point (pI)، الوزن الجزيئي، الشحنة الكهربائية، أو مجموعة من هذه العوامل. طبيعة الفصل تعتمد على طريقة معالجة العينة وطبيعة الهلام.


إلى حد الآن، الطريقة الأكثر شيوعاً للفصل الكهربائي للهلام توظف هلامات متعدد الأكريلامايد polyacrylamide ومحاليل تحتوي على كبريتات دوديكل الصوديوم Sodium Dodecyl Sulfate (SDS).


SDS-PAGE أي (الفصل الكهربائي لهلام كبريتات دوديكل الصوديوم متعددالأكريلامايد SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis) تحافظ على سلسلة البروتيات في حالة مفككة denatured state حالماً يتم معالجتهم مع عوامل اختزال قوية للقضاء على الأشكال الثانوية والثالثية. (مثل تحويل الروابط ثنائية الكبريت S-S إلى SH و SH) وبذلك يسمح لفصل البروتينات حسب وزنهم الجزيئي. يتم تغطية البروتينات في العينة بكبريتات دوديكل الصوديوم السالبة الشحنة ونقلها إلى القطب الكهربائي الموجب الشحنة خلال شبكة الأكريلامايد في الهلام.

البروتينات الصغيرة تهاجر أسرع خلال هذه الشبكة وبذلك يتم فصل البروتينات حسب الحجم (عادة ما يتم قياسها بالكيلودالتون، kD، kiloDaltons). تركيز الأكريلامايد يحدد دقة الهلام - كلما زاد تركيز الأكريلامايد كلما زادت دقة البروتينات ذات الأوزان الجزيئية العالية. البروتينات تهاجر ببعد واحد خلال الهلام لأغلب اللطخات.

image SDS-PAGE Electrophoresis.png


WB-gel الهلام ويلاحظ فيه الدرج بصورة حزم زرقاء اللون بسبب الصبغة الزرقاء كوماسي بلو Coomassie Blue

يتم تحميل العينات في < >آبار في الهلام. يتم حفظ إحدي الأسطر للـ < >درج أو < >العلامات، وهما خليط متوفر تجارياً من عدة بروتينات معروفة الوزن الجزيئي، عادة ما تكون مصبوغة لكي تُظهر حزم ملونة مرئية.


أحد الأمثلة على الدرج، هو درج الأوزان الجزيئية الكامل المدى لشركة GE (كما في الشكل). عندما يتم تطبيق فرق الجهد على الهلام، تهاجر البروتينات ضمنه بسرع مختلفة. هذه المعدلات الزمنية المختلفة للتقدم ( حركة فصل كهربائي حركات الفصل الكهربائي المختلفة) تُفصل إلى < >حُزم ضم كل < >سطر.



من الممكن أيضاً استخدام هلام ثنائي الأبعاد الفصل الكهربائي ثنائي الأبعاد الذي يفصل البروتينات من عينة واحدة في بُعدين. البروتينات تفصل بحسب النقطة متوازنة الكهربة (تركيز أيونات الهيدروجين pH الذي تكون فيه الشحنة متعادلة) في البعد الأول، وبحسب الوزن الجزيئي في البعد الثاني.


النقل



من أجل جعل الوصول للبروتينات أسهل للاكتشاف بالأجسام المضادة، يتم نقلهم من الهلام إلى غشاء مصنوع من النيتروسيليوز أو الـPVDF. يتم وضع هذا الغشاء فوق الهلام، ووضع مجموعة من طبقات أوراق الترشيح فوق ذلك. ثم يتم وضع الطبقات كلها في محلول يقوم بالتنقل إلى الأعلى عبر الأوراق بالخاصية الشعرية Capillary action، جالباً البروتينات معه إلى الغشاء.


ومن الطرق الأخرى لنقل البروتينات تدعى اللطخة الكهربائية وتستخدم تياراً كهربائي لسحب البروتينات من الهلام إلى الغشاء.


البروتينات الآن نُقلت من داخل الهلام إلى سطح غشاء من النيتروسيليلوز أو PVDF مع ثباء الترتيب التي كانت البروتينات عليه داخل الهلام. ويكون ناتج هذه العملية، هو عرض البروتينات على سطح رقيق للاكتشاف (انظر أسفلاً). كلا نوعي الغشاء (نيتروسيليلوز أو PVDF) يتم اختيارهم لخاصية الالتصاق غير المحدد بالبروتيات (أي أنهم يلتصقون بأي بروتين بصورة متساوية). التصاق البروتينات مبني على تفاعلات مصابة بفوبيا الماء hydrophobic interactions)، بالإضافة إلى التفاعلات المشحونة بين الغشاء والبروتين. إن أغشية النيتروسيليلوز تكون أقل كلفة من الـ PVDF، ولكنهم هشة أكثر ولا تستطيع الوقوف لتحقيقات مجددة reprobes كثيرة.Renart J, Reiser J, Stark GR. Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera a method for studying antibody specificity and antigen structure , < >Proc  Natl  Acad  Sci  U  S  A, 1979 Jul 76(7) 3116-20. PMID   91164] [http //www.pnas.org/cgi/content/abstract/76/7/3116 abstract




image Western blot transfer.png


التأثير الكلّي والموحّد لنقل البروتين من الهلام إلى الغشاء يمكن التأكد منه بصبغ الغشاء بصبغة كوماسي Coomassie أو بونسو س Ponceau S. كوماسي هي الصبغة الأكثر حساسية من الصبغتين، بالرغم من أن سهولة ذوبان بونسو س في الماء تجعله أسهل للإزالة لاحقاً والتحقق من الغشاء كما في أدناه.
Towbin H, Staehelin T, Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets procedure and some applications < >Proc  Natl  Acad  Sci  U  S  A, 1979 Sep 76(9) 4350-4. PMID   388439] [http //www.pnas.org/cgi/content/abstract/76/9/4350 abstract




السد


بما أنه تم اختيار الغشاء لقابليته على الالتصاق بالبروتينات، وكلاً من الأجسام المضادة والأهداف هما بروتينات، يجب إتخاذ إجراءات خاصة لمنع التفاعلات بين الغشاء والجسم المضاد المستخدم لاكتشاف البروتين الهدف. يتم سد الالتصاق غير المحدد عن طريق وضع الغشاء في محلول مخفف من بروتين - عادة ما يكون هذا البروتين هو ألبومين مصل البقر Bovine Serum Albumin المعروف بالـ BSA أو حليب من غير دهون (كلاهما ليسا مكلفان)، مع مقدار صغير من منظف مثل توين 20 Tween. البروتين في المحلول المخفف يلتصق بالغشاء في كل الأماكن الغير محتوية على البروتينات الهدف. وبهذا، عندما يتم إضافة الجسم المضاد، لن يكون هناك مكان له ليلتصق غير على مواقع الالتصاق على البروتين الهدف المحدد. هذا يقلل التشويش في النتيجة النهائية للطخة ويسترن، ويؤدي إلى نتائج أوضح، ويقضي على النتائج الإيجابية المزيفة.


الاكتشاف


خلال عملية الاكتشاف، يتم التحقق من وجود البروتين المطلوب على الغشاء عن طريق جسم مضاد معدل مرتبط بإنزيم مراسل، الذي عند وضع مادة معينة عليه يسبب تفاعل لوني ويقوم بإنتاج لون معين. ولعدة أسباب، فإن هذه الخطوة تتم بخطوتين، بالرغم من أن الآن يوجد طرق اكتشاف ذات خطوة واحدة لبعض الاستخدامات.


الخطوتين


  • الجسم المضاد الأولي


  • يتم تكوين الأجسام المضادة عندما يتم عرض البروتين المطلوب (أو جزءاً منه) على المستضيف أو خلايا المناعة المزروعة. عادةً، يكون هذا جزءاً من الاستجابة المناعية، ولكن هنا يتم حصد الأجسام المضادة واستخدامها كأدوات اكتشاف دقيقة وحساسة تلتصق بالبروتين مباشرة.


    بعد عملية السد، يتم احتضان الغشاء في محلول مخفف من الجسم المضاد الأولي (عادة بتركيز بين 0,5 ميكروغرام /مل إلى 5 ميكروغرام/مل) مع التحريك الخفيف. بشكله النموذجي، يحتوي المحلول على محاليل ملحية مع نسبة صغيرة من المنظفات، وأحياناً مسحوق حليب أو ألبومين مصل البقر BSA. يمكن وضع محلول الجسم المضاد والغشاء معاً واحتضانهما لأي فترة بين 30 دقيقة إلى عبر الليل. ويمكن أيضاً احتضانهما في درجات حرارة مختلفة، حيث تكون الدرجات الدافئة أكثر محفزة على الالتصاق (لكلا نوعي الالتصاق، الالتصاق المحدد والالتصاق الغير محدد التشويش ).


  • الجسم المضاد الثانوي


  • بعد تنقيع الغشاء أو غسله لإزالة الأجسام المضادة الأولية الغير ملتصقة، يتم إضافة جسم مضاد آخر للغشاء، موجه نحو جزء خاص-لنوع species-specific الجسم المضاد الأولي. وهذا يعرف بالجسم المضاد الثانوي، وبسبب خواصه المستهدِفة، يتم تسميته بـ ضد-الفأر ، ضد-العنز ، ضد-الجرذ ، الخ. الأجسام المضادة تأتي من مصادر الحيوانات (أو زراعة خلايا هيبريدوما حيوانية)؛ فالجسم المضاد الثانوي ضد-الفأر سيلتصق لأي جسم مضاد أولي مصدره الفأر. وهذا يسمح لتوفير المصاريف بالسماح لكل المختبر من استخدام مصدر واحد من جسم مضاد منتج بكثرة، ويوفر نتائج منسقة أكثر بكثير. عادة ما يكون الجسم المضاد الثانوي مرتبط بجزيئة بايوتين أو إلى إنزيم مراسل مثل فسفاتاز قلوي Alkaline phosphatase أو بيروكسيداز الفجل الحار Horseradish peroxidase. هذا يعني أن عدة أجسام مضادة ثانوية ستلتصق بجسم مضاد أولي واحد وتقوم بتعزيز الإشارة للاكتشاف.

    image Western Blot binding.png


    غالباً ما يتم استخدام جسم مضاد ثانوي مرتبط ب بيروكسيداز الفجل مع عامل مضيء كيميائي، وينتج التفاعل بينهما ضوءاً بمقدار كمية البروتين. يتم استخدام طبقة حساسة من الفيلم الفوتوغرافي لخلق صورة للأجسام المضادة الملتصقة باللطخة.


    كما في إجراءات إيلايزا الإيلايزا إيلايزبوت الإيلايزبوت ، يمكن تزويد الأنزيم بجزيئة التي يحولها الإنزيم إلى ناتج تفاعل ملون يمكن رؤيته على الغشاء.


    البديل الثالث هو استخدام علامة مشعة بدل إنزيم متصل بالجسم المضاد الثانوي، مثل ربط بروتين يلتصق بالأجسام المضادة (مثل بروتين أ من العنقودية Staphylococcus) نظير بنظير مشع من يود اليود . ولكن بما أنه الطرق الأخرى هي أكثر أماناً، وأسرع وأرخص، قلّ ما يتم استخدام هذه الطريقة الآن.


    الخطوة الواحدة


    تأريخياً، كانت عملية التحقق تُجرى بخطوتين وذلك بسبب السهولة النسبية لإنتاج أجسام مضادة أولية وثانوية من ناحية المرونة، وأيضاً يضيف خطوة تكبير للإشارة لعملية الاكتشاف.


    نظراً للقدرة الإنتاجية العالية لتحليل البروتينات وانخفاض حدود الإشارة المطلوبة للكشف، تم تطوير طرق تحقُّق ذات خطوة واحدة والتي تستطيع أن تحدث بصورة أسرع مع تقليل استخدام المستهلكات. وهذا يتطلب جسم مضاد ملتقط الذي يتعرف على البروتين المطلوب ويحتوي على علامات اكتشاف/التقاط، وغالباً ما يكون هناك ملتقطات بروتينات مؤشرة للبروتينات المؤشرة Protein tags. يتم احتضان الملتقط الأولي مع الغشاء بطريقة مشابهة للجسم المضاد الأولي في طريقة الخطوتين، ومن ثم يكون جاهز للكشف بعد سلسلة من خطوات الغسل.


    Blotautoradiogram.png frame لطخة ويسترن باستخدام طريقة الاكتشاف المشع


    التحليل


    بعد أن يتم غسل الملتقطات الغير ملتصقة، تصبح لطخة ويسترن جاهزة للاكتشاف عن طريق الملتقطات الملتصقة بالبروتين المراد اكتشاف وجوده أو عدمه. في المصطلحات العملية، لا تُظهر كل لطخات ويسترن البروتين بصورة حزمة واحدة فقط على الغشاء.

    يتم أخذ تقديرات الحجم عن طريق مقارنة الحزم المكتشفة بحزم الدرج المصبوغة التي تم تحميلها عند خطوة الفصل الكهربائي. يتم إعادة هذه العملية لبروتين هيكلي، مثل الأكتين أو التيوبيولين، الذي لا يجب تغيير تركيزه بين العينات. كمية البروتين الموجودة تتم مقارنتها بالبروتين الهيكلي لكي يتم السيطرة على المجموعات العدة. هذه الطريقة تؤكد تصحيح التغييرات الدارجة بسبب عدم انتقال البروتين أو وجود أخطاء في التجربة.


    الاكتشاف اللوني Colorimetric detection


    طريقة الاكتشاف اللوني تعتمد على احتضان لطخة ويسترن مع المادة التي ستتفاعل مع الإنزيم المراسل (مثل بيروكسيداز البيروكسيداز Peroxidase) الذي يكون مرتبط بالجسم المضاد الثانوي. هذا يحول الصبغة الذائبة إلى شكل غير ذائب بلون مختلف والتي تترسب قرب الإنزيم وبالتالي تصبغ غشاء النيتروسيليلوز. يتم إيقاف تحميض اللطخة عندها عن طريق غسل الصبغة الذائبة. يتم تحليل كمية البروتينات باستخدام قياس الكثافة densitometry (أي ما هي كثافة البقعة/الصبغة) أو قياس الضوء spectrophotometry.


    الإضاءة الكيميائية Ch iluminescence




    تعتمد طريقة الاكتشاف بالإضاءة الكيميائية على احتضان لطخة ويسترن مع المادة التي تضيء عندما تتصل بالجزيء المراسل على الجسم المضاد الثانوي. وعندها يتم التقاط الضوء باستخدام فيلم فوتوغرافي ، ومؤخراً باستخدام كاميرات سي سي دي CCD cameras تلتقط صورة رقمية للطخة ويسترن. هذه الصورة يتم تحليلها باستخدام مقياس الكثافة الذي يحلل كمية الصبغة البروتينية النسبية ويقوم بالتحليل الكمي عن طريق الكثافة الضوئية. يوجد برامج جديدة تساعد على تحليلات البيانات بصورة أخرى مثل تحليل الوزن الجزيئي إذا تم استخدام مقاييس صحيحة. يعتبر ما يسمى ب المضيء الكيميائي المحسن Enhanced ch iluminscent أو ECL هو من ضمن أكثر الطرق حساسية للاكتشاف التحليلي للطخة ويسترن.


    image Western blot ch iluminescent detection.png



    الاكتشاف المشع Radioactive detection


    العلامات المشعة لا تحتاج إلى مواد إنزيمية، ولكن فقط وضع أفلام أشعة سينية طبية مباشرة على لطخة ويسترن والذي يقوم بخلق أجزاء غامقة على الفيلم تعود إلى حزم البروتينات المطلوب كشفها (انظر الصورة). قلت أهمية طرق الاكتشاف المشع، بسبب كونها مكلفة، ولها أخطار صحية عالية، كما أن المضيء الكيميائي المحسن ECL يعتبر بدل مفيد جداً.


    الاكتشاف الفلوري Fluorescent detection


    يتم تحفيز الملتقط ذو العلامات الفلورية بواسطة الضوء والانبعاث من التحفيز وبذلك يتم الاستدلال عليه بواسطة متحسس ضوئي مثل كاميرا سي سي دي المزودة بمرشح باعث مناسب حيث يقوم بألتقاط الصورة الرقمية للطخة ويسترن ويقوم بالسماح لتحليل بيانات أخرى كالوزن الجزيئي والتحليل الكمي للطخة ويسترن. يعتبر الملتقط الفلوري من بين أكثر الطُرق حساسية لتحليل اللطخة.


    التحقق الثانوي


    أحد الاختلافات الكبيرة بين غشائي النيتروسيليلوز و PVDF يعود إلى قابلية كل منهم على القيام بـ تعرية للأجسام المضادة وإعادة الاستخدام لأجسام مضادة ملتقطة لاحقاً. وبالرغم من أن هناك طرق مختبرة لتعرية أغشية النيتروسيليلوز، تظل أغشية الـPVDF أسهل تعرية، وتسهل استخدام أكثر قبل أن يقوم التشويش الخلفي بإعاقة التجارب. أحد الاختلافات الأخرى هو، بعكس النيتروسيليلوز، الـPVDF يجب أن ينقع في 95 إيثانول، بروبانول أو ميثانول قبل الاستخدام. أغشية الـPVDF أيضاً تكون أكثر سمكاً وأكثر مقاومة للضرر خلال الاستخدام.


    الفصل الكهربائي للهلام ببعدين


    2D-SDS-PAGE ثنائي الأبعاد يستعمل المبادئ والتقنيات المُشار إليها اعلاه. كما يشير الاسم، فإن هذه الطريقة تشمل هجرة سلسلة البروتينات في بعدين. في البُعد الأول تقوم السلسلة البروتينية بالأنفصال حسب نقطة التعادل الكهربي. أما في البعد الثاني تنفصل السلسلة البروتينية حسب وزنها الجزيئي. تُقاس نقطة التعادل الكهربي لبروتين مُعين بواسطة الرقم النسبي للأحماض الأمينية الموجبة (ك لايسين اللايسين ) والسالبة (ك جلوتاميت الجلوتاميت ), وتقوم الأحماض الأمينية السالبة بتزويد أعلى نقطة تعادل كهربي, ومن جهة أخرى تقوم الأحماض الامينية الموجبة بتزويد أقل نقطة تعادل كهربي.


    تسمح هذه الطريقة بفصل كل البروتينات الخلوية على هلام مفرد وكبير. من الفوائد المهمة لهذه الطريقة هي التمييز بين الأشكال المُختلفة لبروتين مُعين (مثلاَ البروتين الذي تمت فسفرتهُ، أي إضافة المجموعة السالبة الشُحنة). يُمكن قطع البروتين الذي تم فَصله من الهُلام وبعدها يتم تحليله بواسطة جهاز تحليل الكتلة mass spectrometry الذي يقوم باكتشاف البروتين وتحديد هويته.


    الاستخدامات في الفحص الطبي




    الطرق


  • طريقة مختبر الدكتور مارك بارتون فرانك


  • Western Blot.png تصغير لطخة ويسترن

    في تقانة حيوية التقنيات الحيوية ، لطخة ويسترن إنج Western Blot (تعرف أيضا باللطخة المناعية Immunoblot) هي طريقة اكتشاف بروتين معين في عينة أو مستخلص أنسجة، وهي من التقنيات الحيوية المخبرية. تستخدم الفصل الكهربائي للهلام لفصل البروتينات الطبيعية native proteins أو بروتين مفكك البروتينات المُتَمَسِّخة denatured proteins حسب طول السلاسل البروتينية (ظروف مفككة) أو حسب الشكل الثلاثي الأبعاد للبروتين (ظروف قومية/غير مفككة). يتم، في ما بعد، نقل البروتينات إلى غشاء (عادة ما يكون الغشاء مصنوعا من مادة نيتروسيليلوز النيتروسيليلوز أو PVDF )، حيث يتم التحقق (الاكتشاف) باستخدام أضداد مخصصة للبروتين الهدف. هناك الآن العديد من شركات المواد التي تتخصص في تجهيز أضداد (مستنسخة ومتعددة النسائل) ضد آلاف البروتينات المختلفة. وقد قام هذا بتقليل الوقت الذي تحتاجه لعمل لطخة بصورة كبيرة.



    كان يجب، سابقًا، تلقيح الحيوانات الكبيرة (مثل خروف الخرفان ، عنز العنز - يحتويان على الكثير من مصل المصل ) بالبروتين المستهدف مرتين (حيث أن الاستجابة المناعية الثانية تنتج أضدادا أكثر). ومن ثم إما يتم تصفية المصل واستخدامه (أضداد متعددة النسائل - Polyclonal -) أو يمكن فصل الخلايا البائية من الحيوان ودمجها خارج الجسم < >in vitro مع خلايا فأر سرطان سرطانية لتوليد خلايا هيبريدوما التي تستطيع في ما بعد إنتاج أضداد وحيدة النسيلة (Monoclonal).



    الأضداد التجارية عادة ما تكون مكلفة، ولكن يمكن إعادة استخدامها (استخدام ما يتبقى من الأجسام المضادة غير الملتصقة) بين التجارب. هذه الطريقة تستخدم في الأحياء الجزيئية ، الكيمياء الحيوية ، و علم الجينات المناعية Immunogenetics وعدة أخرى من علوم الأحياء الجزيئية.


    من التقنيات الأخرى المتعلقة هي استخدام الأجسام المضادة لاكتشاف البروتينات في الأنسجة أو الخلايا باستخدام صبغة مناعية الصبغة المناعية Immunostaining و إلايزا الإلايزا ELISA.


    تم صنع هذه الطريقة في مختبر جورج ستارك في جامعة ستانفورد عام 1981. قام وولتر نيل بورنيت بتسميتها باسم لطخة ويسترن ، Cite journal
    author W. Neal Burnette

    'Western blotting' electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate — polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A

    journal Anal Bioch


    year 1981

    month April

    volume 112

    issue 2

    pages 195-203



    PMID   6266278] [http //dx.doi.org/10.1016/0003-2697(81)90281-5 doi 10.1016/0003-2697(81)90281-5
    Citation's Classic Burnette



    وهو مشتق من اسم لطخة جنوبية اللطخة الجنوبية (Southern Blot لغة إنكليزية بالإنكليزية ، من Southern وهي نسبة إلى إدون ساذرن Edwin Southern، والتي تعني أيضا الجنوبي لغة إنكليزية بالإنكليزية . فسميت التقنية الجديدة بـويسترن، تلاعبا بالمعنى). و لطخة جنوبية اللطخة الجنوبية تقنية لاكتشاف حمن الحمض الريبي النووي منقوص الأكسجين DNA، قام إدون ساذرن Edwin Southern بصنعها عام 1975. تسمى طريقة اكتشاف حرن الحمض الريبي النووي RNA باسم لطخة شمالية اللطخة الشمالية .

     
    التعليقات (1 تعليق)

    (اضيف قبل 1 سنة و 7 شهر)
    تبليغ عن اساءة

    انسخ الارقام تحتهم


    زائر     طلب حذف التعليق
    مفيد جداً
     


    اعلانات
    تصنيفات الموقع
    شاهد الجديد لهذه المواقع

      Warning: Invalid argument supplied for foreach() in /home/mdar/public_html/w/et2/1504449754footer.html.php on line 106

      Warning: Invalid argument supplied for foreach() in /home/mdar/public_html/w/et2/1504449754footer.html.php on line 110
    بئر السبع ميسوكسيمايد تل هشومير المرجة الزرقاء أسامة بن زيد الغاف دراسة جدوى خطة عمل روبرك الطاقة الداخلية مذكرات دورية نحو الشرق ايو جيما العياضي برباس العياضي شركة مكافحة حشرات خوارزمية ديكسترا مرفأ بيروت الكايد طاش ما طاش شركة كايد البسقلون كورونا سد حراض الفن البيزنطي عبد السلام بنعبد العالي رائد عودة مستشفى طيبة التخصصي غزوة خيبر شركة فواز لعامة للدراسات والمستندات كلوفيس الأول لمع قطع الغيار جميل خطاب ويلان نظم المعلومات المحاسبية محمود بن محمود البان باقادر مؤسسة بن شيهون الصحة الحقن المجهري الصين معلمات اتجاه البطولي أرضروم تنافسية شكاوي محمد الحاج سالم تكرلي مبرهنة عدم الاكتمال علاج عرق النسا سنهدريم التكامل العددي كهربا الحكومة الحكومة التونسية مسالك بولية معاهدة فاليتا مستشفي بدر مشاغل مراكز التجميل محمد حافظ الشريدة وديع سعادة مشغل جرافيزم شكا الربان حديقة التجارة نقليات الهباس بن دعجم بطباط حمود بوعلام حميدة معركة ثابسوس براتا البن الاخضر الزكاه ديدفورت تاريخ فواصل الكتب توسعة المسجد النبوي نادي الفتح telnet 1978 عصبام اللوزتين سبيكمان 213 الاقتصاد رمادي عادي فندق العليا تشويه سمعه اسماك الأسماك مؤسسة الجهاز القلبي الوعائي italia قراي
    أخبار السعودية اليوم الاحد 24/02/2019 - أخبار قطر اليوم الاحد 24/02/2019 - أخبار الإمارات اليوم الاحد 24/02/2019 - أخبار الكويت اليوم الاحد 24/02/2019 - أخبار السياحة اليوم الاحد 24/02/2019 - أخبار البحرين اليوم الاحد 24/02/2019 - أخبار المغرب اليوم الاحد 24/02/2019 - أخبار الاردن اليوم الاحد 24/02/2019 - أخبار فلسطين اليوم الاحد 24/02/2019 - أخبار عمان اليوم الاحد 24/02/2019 - أخبار لبنان اليوم الاحد 24/02/2019 - أخبار السودان اليوم الاحد 24/02/2019 - أخبار الكورة اليوم الاحد 24/02/2019 - اعلانات الحراج اليوم الاحد 24/02/2019 - اسعار السيارات بالكويت الاحد 24/02/2019 - اسعار العقارات بالكويت الاحد 24/02/2019