أكثر التداولات لليوم سعر صرف دينار كويتى مقابل ريال سعودي اليوم - سعر صرف دينار ليبي مقابل دينار تونسي اليوم - سعر صرف ريال سعودي مقابل ريال يمنى اليوم - سعر صرف دينار ليبي مقابل جنية مصري اليوم - سعر صرف يورو مقابل درهم مغربي اليوم - سعر صرف ريال سعودي مقابل درهم مغربي اليوم - سعر صرف دينار اردنى مقابل جنية مصري اليوم - سعر صرف دينار كويتى مقابل جنية مصري اليوم - سعر صرف دولار امريكي مقابل ريال سعودي اليوم - سعر صرف يورو مقابل الدينار الجزائري اليوم - سعر صرف دينار اردنى مقابل ريال سعودي اليوم - سعر صرف ريال سعودي مقابل جنية مصري اليوم - سعر صرف دينار اردنى مقابل شيكل اليوم - سعر صرف دينار تونسي مقابل الدينار الجزائري اليوم - سعر صرف دولار امريكي مقابل ليرا تركيا اليوم - سعر صرف ريال سعودي مقابل الدينار الجزائري اليوم - سعر صرف رينغيت ماليزي مقابل ريال سعودي اليوم - سعر صرف يورو مقابل ريال سعودي اليوم - سعر صرف دولار امريكي مقابل جنية مصري اليوم - سعر صرف ريال عمانى مقابل جنية مصري اليوم - سعر صرف دولار امريكي مقابل درهم مغربي اليوم - سعر صرف فرانك سويسري مقابل ريال سعودي اليوم - سعر صرف جنية مصري مقابل ريال سعودي اليوم - سعر صرف يورو مقابل دينار تونسي اليوم - سعر صرف درهم اماراتى مقابل ريال سعودي اليوم - سعر صرف يورو مقابل دولار امريكي اليوم - سعر صرف الوون الكوري مقابل جنية مصري اليوم - سعر صرف ريال سعودي مقابل دولار امريكي اليوم - سعر صرف ريال سعودي مقابل الروبية الاندونيسية اليوم - سعر صرف ريال قطري مقابل جنية مصري اليوم - سعر صرف ريال سعودي مقابل ليرا تركيا اليوم - سعر صرف درهم اماراتى مقابل درهم مغربي اليوم - سعر صرف دينار كويتى مقابل دولار امريكي اليوم - سعر صرف ريال سعودي مقابل دينار اردنى اليوم - سعر صرف دينار عراقي مقابل ريال سعودي اليوم - سعر صرف يورو مقابل ليرا تركيا اليوم - سعر صرف دينار ليبي مقابل يورو اليوم - سعر صرف دينار بحرينى مقابل ريال سعودي اليوم - سعر صرف ريال سعودي مقابل دينار كويتى اليوم - سعر صرف الدينار الجزائري مقابل ريال سعودي اليوم - سعر صرف دولار كندى مقابل ريال سعودي اليوم - سعر صرف جنية مصري مقابل دولار امريكي اليوم - سعر صرف دولار امريكي مقابل دينار عراقي اليوم - سعر صرف ريال سعودي مقابل دينار ليبي اليوم - سعر صرف دولار امريكي مقابل كرونا سويدي اليوم - سعر صرف ريال سعودي مقابل دينار تونسي اليوم - سعر صرف ريال سعودي مقابل الوون الكوري اليوم - سعر صرف يورو مقابل جنية مصري اليوم - سعر صرف يورو مقابل دينار كويتى اليوم - سعر صرف ريال يمنى مقابل ريال سعودي اليوم - سعر صرف دينار كويتى مقابل ليرا تركيا اليوم - سعر صرف الجنية الأسترلينى مقابل ريال سعودي اليوم - سعر صرف ريال عمانى مقابل ريال سعودي اليوم - سعر صرف دولار امريكي مقابل الوون الكوري اليوم - سعر صرف ريال سعودي مقابل رينغيت ماليزي اليوم - سعر صرف دينار عراقي مقابل ليرة تركية جديدة اليوم - سعر صرف ريال سعودي مقابل بيزو فلبينى اليوم - سعر صرف جنية مصري مقابل كرونا سويدي اليوم - سعر صرف دينار ليبي مقابل درهم مغربي اليوم - سعر صرف دولار امريكي مقابل دينار تونسي اليوم - سعر صرف ريال قطري مقابل درهم مغربي اليوم - سعر صرف دينار ليبي مقابل الدينار الجزائري اليوم - سعر صرف دينار تونسي مقابل دينار ليبي اليوم - سعر صرف دولار كندى مقابل جنية مصري اليوم - سعر صرف دولار امريكي مقابل الروبية الاندونيسية اليوم - سعر صرف دولار امريكي مقابل CFA الفرنك (BCEAO) اليوم - سعر صرف ريال سعودي مقابل ريال سعودي اليوم - سعر صرف دينار كويتى مقابل ريال قطري اليوم - سعر صرف يوان الصينى مقابل ريال سعودي اليوم - سعر صرف دينار ليبي مقابل ريال سعودي اليوم - سعر صرف ريال سعودي مقابل روبي الهند اليوم - سعر صرف ريال سعودي مقابل ليرة تركية جديدة اليوم - سعر صرف كرونا سويدي مقابل دولار امريكي اليوم - سعر صرف ريال قطري مقابل دينار تونسي اليوم - سعر صرف الروبية الاندونيسية مقابل ريال سعودي اليوم - سعر صرف ليرا تركيا مقابل ريال سعودي اليوم - سعر صرف دينار سوداني مقابل ريال سعودي اليوم - سعر صرف روبية سريلانكية مقابل ريال سعودي اليوم - سعر صرف ريال سعودي مقابل دينار عراقي اليوم - سعر صرف ين يابانى مقابل جنية مصري اليوم - سعر صرف دولار امريكي مقابل ليرة تركية جديدة اليوم - سعر صرف الدينار الجزائري مقابل ريال قطري اليوم - سعر صرف الجنية الأسترلينى مقابل دولار امريكي اليوم - سعر صرف شيكل مقابل الدينار الجزائري اليوم - سعر صرف ريال قطري مقابل الدينار الجزائري اليوم - سعر صرف الجنية الأسترلينى مقابل جنية مصري اليوم - سعر صرف دولار امريكي مقابل ريال يمنى اليوم - سعر صرف دولار امريكي مقابل رينغيت ماليزي اليوم - سعر صرف الوون الكوري مقابل ريال سعودي اليوم - سعر صرف اونصة الذهب مقابل دولار امريكي اليوم - سعر صرف جنية مصري مقابل دينار اردنى اليوم - سعر صرف دينار اردنى مقابل كرونا سويدي اليوم - سعر صرف رينغيت ماليزي مقابل دولار امريكي اليوم - سعر صرف درهم مغربي مقابل يورو اليوم - سعر صرف غواراني باراغواي مقابل جنية قبرصي اليوم - سعر صرف ريال سعودي مقابل تاكا بنجلاديش اليوم - سعر صرف درهم مغربي مقابل ريال سعودي اليوم - سعر صرف دينار بحرينى مقابل جنية مصري اليوم - سعر صرف دولار استرالى مقابل ريال سعودي اليوم - سعر صرف دينار ليبي مقابل دينار كويتى اليوم -
أعلانات الحراج للايجار ملحق فى عبدالله المبارك بالكويت - للبيع بيت مدخول بالمنقف - للبيع مجمع تجاري السالميه - مطلوب بيت حكومي للبيع مدينه سعد العبدالله - للبيع او للضمان - للبيع في الخيران السكني فيلا دورين مساحة 600 - الرحاب - للبيع قسايم بجابر ::: النعيم - للبيع عقارات بالعاصمة - للبيع بيت بالفنيطيس - للبيع بيت في العارضيه ق6 - للبيع بيت الاحمدي مساحهظ¢ظ¥ظ¦م بطن وظهر علي وضع الحكومه - للبيع في سلوى فيلا 3أدوار نظام شقق زاوية - للبيع شيفروليه كابرس بالكويت - للبيع فلل نظيفه جدا فى عموم جنوب السره - للبيع فلل في منطقة السلام - بأسعار تنافسية تملك شقة فاخرة بالفنطاس بناية جديدة بوثيقة جاهزة - للبيع عماره صباح السالم - الصباحيه راس ثلاث جهات شارع رئيسي دخل 6 الف - للبيع فيلا في جابرالاحمد - منازل للبيع ببيان والجابرية وعبدالله مبارك وغرناطة - للبدل سعد العبدالله مع غرب ع المبارك - للبيع سيارة سيات توليدو بالكويت - ام الهيمان - من المالك فقط..مطلوب صباح السالم..العدان ..القصور..القرين..مبارك الكبير..(حابر العلي قظ§ اوظ¨) - للبيع الجابرية مساحة ظ،ظ¥ظ ظ م بجانب مركز سلطان - للبيع بيت في الصليبيخات - للبيع فيلا ضاحية - للبيع بيت حكومه جابر العلي - للبيع فيلا بيان. ارض ف الجابريه هدام ف المناطق الدخليه - للبيع بالمنقف و بالصباحيه - للبيع قصر بالجابرية - حولي - قسيمتك عندنا. بدور علي موقع بدور علي قطاع بدور علي سعر مناسب خش شوف الاعلان - للبيع - للبيع بلوك فى العقيله وأرضى فى ابو فطيره - محل تمليك - للبيع بيت بجابر الاحمد راس بجانب المسجد - الجايرية - للبيع - صباح السالم - الجابريه - للبيع بالجهراء /القصر - لدينا قسايم بجابر الاحمد - للبيع قسيمه صناعيه الفحاحيل مساحه ظ،ظ ظ ظ م بطن وظهر ارتداد كبير - للبيع بلوك اراضي في ابو فطيرة قطعة / ظ¨ - شيفروليه كروز للبيع بالكويت - للايجار فيلا بكيفان فالكويت - للبيع شقة تمليك بالجابرية - للبيع بيت حكومي في الفردوس -
الجديد كيف تبداء بمشروع صغير وناجح ؟ - كيف تصبح غنياً ؟ - كيف توفر المال ؟ - طريقه التخلص من سواد الابط - ما هي فوائد الخل للشعر ؟ - طريقه سهله لازاله البقع من السجاد - اسهل طريقه ل غسل الأحذيه - ضيغم بن خشرم -
آخر المشاهدات منى أبو سليمان الطفولة - عنوان وهواتف سفارة اليونان فى السعودية ومعلوات عنها - هاتف و معلومات عن مجمع عيادات محمد حسن كافي بالمدينة المنورة - عبير جابر أعمالها - حاصرات مستقبلات بيتا الأعراض الجانبية - سور القران لكل شهر من شهور الحمل - قطب قياسي للهيدروجين العلاقة بين القطب القياسي للهيدروجين والقطب المعتاد للهيدروجين - هاتف وعنوان مستوصف العروبة الطبي - الشفا, مدينة الرياض - سيتوكروم 2D6 الوظيفة - هاتف وعنوان مكتب القحطاني للإستقدام - جيزان, جازان - طريقة تحضير جبان كلوبان بطريقة سهلة - هاتف وعنوان مستشفى الدكتور غسان نجيب فرعون - خميس مشيط, عسير - هواتف مكتب الضمان الاجتماعى بجده ومعلومات عنها بالسعودية - طريقة تحضير بهارات الكاجن بطريقة سهلة - المتممات المجرورة - جلفانوستات التحقيق الفني - عائذ نسبها - وصفة لعلاج الربو و حساسية الصدر بالاعشاب الطبيعية - جامعة طرابلس الشهادات التي تمنحها - كلية ابن سينا رسوم الكلية - هاتف وعنوان مستشفى الأهلي السعودي - العزيزيه, مكة المكرمة - ديربورن اندبندنت ديربورن اندبندنت - ملاحظات رجل مسن داعر - هواتف شركة الحداري للتجارة والمقاولات ومعلومات عنها بالسعودية - هاتف وعنوان المستشفى التخصصي بأبها - ابها, مدينة ابها - طريقة تحضير المصابيب القصيمي بطريقة سهلة - هاتف وعنوان مستوصف الفارابي - السويدي, مدينة الرياض - مشهد (إيران) الموقع - متعة الجنس (كتاب) - وصفة من الاعشاب لعلاج مرض الشرى (الارتيكاريا) - متلازمة الحذف 22q13 الاعراض - يا حلوة مع السلامة (أغنية) Bella Ciao - فيجوال فوكس برو التاريخ الحديث - هواتف الشركة الاحديه للمقاولات والتجاره والصناعه المحدوده ومعلومات عنها بالسعودية - برازرز سياستها مع ممثليها - هاتف و معلومات عن شركة العوفي لتأجير السيارات بالمدينة المنورة - هزارة أصل نشوء الهزارة - طريقة عمل بتر تشكين من منال العالم - ميزانية و تكاليف ودراسة جدوى مشروع إنتاج الصابون السائل - ولاية الحوض الغربي الموقع - برن (رشاش) مرجع - الجيش البريطاني التاريخ - قائمة مواقع الإنترنت الأكثر زيارة مقاييس الترتيب - هاتف و معلومات عن مجموعة شركة الطيار بالمدينة المنورة - عمرو بن عبد ود اسمه ونسبه - إيزابيل إيبرهارت نشأتها - طريقة عمل الكروسان من حلقات برنامج منال العالم - أمينة بن خضراء - طريقة اعداد الأرز الأبيض المفلفل بالذ طعم خطوة بخطوة - وصفة هائلة من الطب البديل لعلاج مشاكل الدوره الشهرية و الحيض بالاعشاب - علي الهويريني السيرة الذاتية - كشف الأخطاء وتصحيحها التعريفات - تلبيسة الاسنان .. هل يمكن ازالة التلبيسه الدائمه؟ - اتحاد المغرب العربي فكرة الاتحاد المغاربي - ولاية الأغواط الجغرافيا - وصفة هائلة من الطب البديل لعلاج امراض القدم والارجل بالاعشاب - بنو مالك بن تميم (موالك قطر) من هم بني مالك بن تميم ‏.؟. - مذكرة تاناكا تاريخ الوثيقة - طريقة تحضير خبز النان الهندي من الشيف منال العالم - ظفار يريم المعالم الأثرية - هاتف وعنوان مكتب أعمال الفاء للإستقدام - البكيريه, القصيم - ليلي إلب - هاتف وعنوان عيادة الدكتور محمد البواردي - المرسلات, الرياض - هاتف وعنوان المستوصف السعودي الطبي - بريده 2, القصيم - فرط نشاط المثانة العلامات و الأعراض - جزيرة الوحيشي - هاتف وعنوان مجمع عيادات الدكتور غسان نجيب فرعون لطب الأسنان - الطائف المركزي, الطائف - وصفة هائلة من الطب البديل لعلاج النحافه و فقر الدم وضعف الجسم بالاعشاب - وصفة تساعد على التئام الجروح: بسرعة بخلطات الاعشاب - وصفات تعمل بالمنزل - وصفة هائلة من الطب البديل لعلاج الالتهاب الكيسي والأوتار بالاعشاب - طريقة تحضير حلى كوكيز بالشوكولاتة السريعة للشيف منال العالم - وصفة هائلة من الطب البديل لعلاج القولون بالاعشاب - السلطة القضائية السودانية تاريخ القضاء السوداني - محمد داود سيرته - طريقة عمل طبخة الدجاج او المكسيكي المكسيكانو من مطبخ منال العالم - هاتف وعنوان معرض بيت الشرق للمطابخ والابواب - حفر الباطن, الجبيل - دراسة جدوى جاهزة لعمل مشروع محل تعبئة وبيع اسطوانات غاز - هاتف وعنوان الشركة الإسلامية للإستثمار الخليجي - الشرفيه, جدة - طريقة عمل إيدام الدبه اوالقرع الأخضر بطعم لذيذ لا تفوتك - طريقة عمل كبة مع صلصة البندورة ودبس الرمان من مطبخ الشيف منال العالم - ميزانية و تكاليف ودراسة جدوى مشروع إنتاج أحذية جلدية للتصدير - مخاطر صاعق الحشرات الكهربائي - داء الليشمانيات الجلدي التسميات المحلية - طريقة تحضير حلى الرخام من كتاب النخبة بطريقة سهلة - وصفة طبيعية من الطب البديل لعلاج إلتهاب المهبل بالاعشاب - يوميات ونيس (مسلسل) الممثلون - هاتف وعنوان مستشفى غسان نجيب فرعون - السلامه, جدة - ميناكشي شيشادري حياتها الفنية - البوسنة والهرسك أصل التسمية - نصرت فتح علي خان السيرة الذاتية - تسقية (صناعة) تقسية المعدن بالتسقية - طريقة تحضير اللوبيا الخضراء مع اللحم من الشيف منال العالم - قرية ال نشوان - الرونة (حبيش) المحلات التابعة للقرية - صالح بن حسن العفالق نسبه - طريقة عمل اللحم المحمر مع الارز المندي مثل المطاعم - مسحوق الخمس بهارات المكونات وطريقة التحضير - لبلاب سام (فيلم 1992) القصة - كبينة الهاتف (فيلم) قصة الفيلم - ظاهرة الحقل الازرق داخل العين التفسير - مندائية البسمله الصابئية المندائية الناصورائية - قبيلة الهزازي أقسام قبيلة الهزازي - خلطة مجربة لعلاج تاخر الحمل وهرمون الحليب وتكيس المبايض - نوتان - فيزا عمل للسعودية ,, شروط واجراءات استخراجها - برتيتا (فيلم) ملخص الفيلم - محمد حسين زيدان المولد والنشأة - طريقة عمل اكلة يخنة القرنبيط من طبخات منال العالم - قائمة حكام الصين قائمة الملوك - طريقة طبخ صينيه التوست المحشيه بالتونه بالصور بطعم لذيذ لا تفوتكم - حي الندوه (الرياض) أهم الشوارع الرئيسية - خصائص الوصف انواع الوصف - معراج السعادة (كتاب) أسلوب الکتابة - طريقة تحضير شوربة "كريم دوفلاي خطوة بخطوة - جروان سالم نبذة عن حياته - عزيز الحطاب افلامه - متلازمة لازاروس بعض الحالات - هاتف وعنوان مستوصف اكسير الدولي - البطحاء, مدينة الرياض - حلقات الديك نصائح للاستعمال - هواتف مستشفى الصحة النفسية و معلومات عنها فى بجــــــازان بالسعودية - حدسية هودج الهندسة بدون أشكال - العطل الرسمية في روسيا عطلة رأس السنة - قبيلة المشاييخ نسب المشاييخ - هواتف مكتب الضمان الاجتماعى بالأحساء ومعلومات عنها بالسعودية - هواتف مكتب الضمان الاجتماعى ببريده ومعلومات عنها بالسعودية - الشروط الواجب توفرها للحصول على تأشيرة العمرة من السفارة السعودية بالمغرب - وقعة طلال الثانية (1290) ما قبل المعركة - هاتف وعنوان شركة بومباي للاكسسوارات والاثاثات المنزلية - العليا, مدينة الرياض - مديرية خمر من أشهر أعلام مدينة خمر - شروط نقل ملكية المؤسسات بالتنازل أو البيع بالسعودية - طريقة عمل وصفة بسكوت انجليزي على طريقة منال العالم - محاولة انقلاب 1955 في السعودية - هاتف وعنوان مطعم نادي المجد - ينبع - حمار بواتو - زاوية الطور تعريف - طريقة عمل كرات اللحم بالصلصة اشهى وصفات رمضان من منال العالم - هاتف وعنوان مستشفى دار الشفاء الاهلي - المربع, مدينة الرياض - مرتشي - طريقة عمل البطاطا المقرمشة من حلقات برنامج منال العالم - هاتف وعنوان مركز الدكتور عبد السلام الطبي - خميس مشيط, عسير - الرحبيين (القلعيين) أصل القبيلة و تاريخها - هواتف مكتب الضمان الاجتماعى بعرعر ومعلومات عنها بالسعودية - اسباب وعلاج كبر محيط راس الطفل او كبر حجم الرأس عند الاطفال - هاتف وعنوان مشغل الآسرة العربية - بحره, مكة المكرمة - قصائد إيدا قصائد إيدا الشعرية - كيفية التدريب على اطالة عملية الجماع و علاج سرعة القذف - عبد الرفيع جواهري مسيرته الإبداعيّة و العمليّة - هاتف وعنوان مستشفى الفلاح الدولي - حي غبيراء, مدينة الرياض - حمود بوعلام (شركة) التاريخ - الطمحة (قبيلة) نسبهم - أساطير نارت الشركسية أكثر الملاحم شهرة - الأمير عفاس بن محيا - وصفة هائلة من الطب البديل لعلاج الروماتيزم أمراض العظام والمفاصل بالاعشاب - وصفة لعلاج التهاب المفاصل و آلام العضلات بخلطات الاعشاب - وصفات تعمل بالمنزل - منيرة بنت عبد الرحمن بن جبر الرشيد - نشيد الوداع الكلمات الأصلية - قطع بنفث الماء - هاتف وعنوان مستوصف الملحم - الجامعه, الاحساء - طريقة تحضير الشاي الليبي..العاله اللليبيه والثالثه باللوز بالصور - قبيلة الجوازي نسب القبيلة - أسلوب التعجب أنواع التعجب - سعود بن هذلول بن ناصر الثنيان آل سعود تعريف - ولاية جوزجان وصفها - جنزور الموقع الجغرافي - مسكيانة لمحة تاريخية لمدينة مسكيانة - طائرة ورقية (هندسة رياضية) خصائص شكل الطائرة الورقية - الساموراي الأخير (فيلم) قصة الفيلم - قائمة أعلام السودان أكاديميون سودانيون - كربيد الكالسيوم الخواص - دينار أغلبي الدينار الأغلبي ب صقلية وجنوب إيطاليا - معيار راوث-هورتز للاستقرارية العيار - حل الدولة الواحدة الموقف والدعوة لحل الدولة الواحدة تاريخيا - غالي مختار فال البصادي اسمه ونسبه - ملحمة خصائص الملحمة - جزيرة الكنز ملخص الرواية - دورة كارنو وصف دورة كارنو - حمصة الكي - هانسل وغريتل ملخص القصة - أبو قرة اليفرني مؤسس مدينة أغادير (تلمسان) - إمارة أنطاكية النشأة - صيد الريم (أغنية) كلمات الاغنية - المير اصول وقبائل - بنعيسى الجيراري اعماله - فحص سريري خطوات الفحص السريري - ملهم (حريملاء) - إنتل 8086 المسجلات في المعالج - سكان ألبانيا الدين - التهاب النخاع المستعرض الأعراض والعلامات - سمندل مائي خصائص البرمائيات - ولي الدين القادري نسبه - حلاق درب الفقراء (فيلم) - سيبيلا ملكة أورشليم نشأتها - هاند ريمي حساب الأوراق - ليزا جين سميث أعمالها - عين البيضاء (ولاية ورقلة) الموقع الجغرافي - قبيلة الرحامنة أصل ونسب القبيلة - شعيفان محمد عن حياته - الكرة الحديدية قواعد اللعبة - خارطة أم راكان (مسلسل) - مارا كرواتو حياتها -
اليوم: الاحد 18 فبراير 2018 , الساعة: 6:11 ص
آخر تحديث للموقع قبل 11 يوم و 16 ساعة

اسعار صرف العملات ليوم الاحد 18/02/2018


اعلانات
موضوع اليوم
 0555833422 مظلات سيارات الرياض الغاط الزلفي شقرا 0555833422 مظلات سيارات الرياض الغاط الزلفي شقرا مسابح مظلات عامة مظلات فوم مظلات قماشية مظلات مواقف سيارات مظلات هرمية مظلات حدائق مظلات شراعية مظلات سيارات مظلات لكسان سواتر مجدولة سواتر شرائح سواتر مجدول
0 تعليق
هنا يظهر الأكثر مشاهدة خلال 24 ساعة

لطخة ويسترن خطوات لطخة ويسترن

نشر قبل 1 سنة و 4 شهر 193 مشاهدة


اعلانات
شاركنا رأيك بالموضوع

خطوات لطخة ويسترن


تحضير الأنسجة



يمكن أخذ العينات من أنسجة كاملة أو من زراعة الخلايا. يتم كسر الأنسجة الصلبة ميكانيكيًا، في أغلب الأحيان، باستخدام خلاّط (لإحجام عينات كبيرة)، باستخدام مجنس homogenizer (للأحجام الأصغر)، أو الصوتنة بالصوتنة Sonication. يمكن كسر وفتح الخلايا بإحدى الطرق المذكورة أعلاه أيضًا.


يمكن توظيف العديد من المنظفات والأملاح والمحاليل لتشجيع التكسر الخلوي ولإذابة البروتينات. يتم أيضًا إضافة مثبطات (موانع) البروتييزات والفسفاتازات Protease and Phosphatase Inhibitors وذلك لمنع تآكل العينة بإنزيماتها الخاصة.


يتم استخدام مجموعة من التقنيات الميكانيكية والكيمياحيوية (البايوكيميائية) من ضمنها أيضًا العديد من أنواع التصفية و طرد مركزي الطرد المركزي لفصل أجزاء أو عضيات معينة من الخلايا.


image SDS-PAGE sample.png


الفصل الكهربائي للهلام


مفصلة فصل كهربائي للهلام


يتم فصل بروتينات العينة باستخدام فصل كهربائي الفصل الكهربائي . فصل البروتينات قد يكون باستخدام النقطة متوازنة الكهربة Isoelectric point (pI)، الوزن الجزيئي، الشحنة الكهربائية، أو مجموعة من هذه العوامل. طبيعة الفصل تعتمد على طريقة معالجة العينة وطبيعة الهلام.


إلى حد الآن، الطريقة الأكثر شيوعاً للفصل الكهربائي للهلام توظف هلامات متعدد الأكريلامايد polyacrylamide ومحاليل تحتوي على كبريتات دوديكل الصوديوم Sodium Dodecyl Sulfate (SDS).


SDS-PAGE أي (الفصل الكهربائي لهلام كبريتات دوديكل الصوديوم متعددالأكريلامايد SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis) تحافظ على سلسلة البروتيات في حالة مفككة denatured state حالماً يتم معالجتهم مع عوامل اختزال قوية للقضاء على الأشكال الثانوية والثالثية. (مثل تحويل الروابط ثنائية الكبريت S-S إلى SH و SH) وبذلك يسمح لفصل البروتينات حسب وزنهم الجزيئي. يتم تغطية البروتينات في العينة بكبريتات دوديكل الصوديوم السالبة الشحنة ونقلها إلى القطب الكهربائي الموجب الشحنة خلال شبكة الأكريلامايد في الهلام.

البروتينات الصغيرة تهاجر أسرع خلال هذه الشبكة وبذلك يتم فصل البروتينات حسب الحجم (عادة ما يتم قياسها بالكيلودالتون، kD، kiloDaltons). تركيز الأكريلامايد يحدد دقة الهلام - كلما زاد تركيز الأكريلامايد كلما زادت دقة البروتينات ذات الأوزان الجزيئية العالية. البروتينات تهاجر ببعد واحد خلال الهلام لأغلب اللطخات.

image SDS-PAGE Electrophoresis.png


WB-gel الهلام ويلاحظ فيه الدرج بصورة حزم زرقاء اللون بسبب الصبغة الزرقاء كوماسي بلو Coomassie Blue

يتم تحميل العينات في < >آبار في الهلام. يتم حفظ إحدي الأسطر للـ < >درج أو < >العلامات، وهما خليط متوفر تجارياً من عدة بروتينات معروفة الوزن الجزيئي، عادة ما تكون مصبوغة لكي تُظهر حزم ملونة مرئية.


أحد الأمثلة على الدرج، هو درج الأوزان الجزيئية الكامل المدى لشركة GE (كما في الشكل). عندما يتم تطبيق فرق الجهد على الهلام، تهاجر البروتينات ضمنه بسرع مختلفة. هذه المعدلات الزمنية المختلفة للتقدم ( حركة فصل كهربائي حركات الفصل الكهربائي المختلفة) تُفصل إلى < >حُزم ضم كل < >سطر.



من الممكن أيضاً استخدام هلام ثنائي الأبعاد الفصل الكهربائي ثنائي الأبعاد الذي يفصل البروتينات من عينة واحدة في بُعدين. البروتينات تفصل بحسب النقطة متوازنة الكهربة (تركيز أيونات الهيدروجين pH الذي تكون فيه الشحنة متعادلة) في البعد الأول، وبحسب الوزن الجزيئي في البعد الثاني.


النقل



من أجل جعل الوصول للبروتينات أسهل للاكتشاف بالأجسام المضادة، يتم نقلهم من الهلام إلى غشاء مصنوع من النيتروسيليوز أو الـPVDF. يتم وضع هذا الغشاء فوق الهلام، ووضع مجموعة من طبقات أوراق الترشيح فوق ذلك. ثم يتم وضع الطبقات كلها في محلول يقوم بالتنقل إلى الأعلى عبر الأوراق بالخاصية الشعرية Capillary action، جالباً البروتينات معه إلى الغشاء.


ومن الطرق الأخرى لنقل البروتينات تدعى اللطخة الكهربائية وتستخدم تياراً كهربائي لسحب البروتينات من الهلام إلى الغشاء.


البروتينات الآن نُقلت من داخل الهلام إلى سطح غشاء من النيتروسيليلوز أو PVDF مع ثباء الترتيب التي كانت البروتينات عليه داخل الهلام. ويكون ناتج هذه العملية، هو عرض البروتينات على سطح رقيق للاكتشاف (انظر أسفلاً). كلا نوعي الغشاء (نيتروسيليلوز أو PVDF) يتم اختيارهم لخاصية الالتصاق غير المحدد بالبروتيات (أي أنهم يلتصقون بأي بروتين بصورة متساوية). التصاق البروتينات مبني على تفاعلات مصابة بفوبيا الماء hydrophobic interactions)، بالإضافة إلى التفاعلات المشحونة بين الغشاء والبروتين. إن أغشية النيتروسيليلوز تكون أقل كلفة من الـ PVDF، ولكنهم هشة أكثر ولا تستطيع الوقوف لتحقيقات مجددة reprobes كثيرة.Renart J, Reiser J, Stark GR. Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera a method for studying antibody specificity and antigen structure , < >Proc  Natl  Acad  Sci  U  S  A, 1979 Jul 76(7) 3116-20. PMID   91164] [http //www.pnas.org/cgi/content/abstract/76/7/3116 abstract




image Western blot transfer.png


التأثير الكلّي والموحّد لنقل البروتين من الهلام إلى الغشاء يمكن التأكد منه بصبغ الغشاء بصبغة كوماسي Coomassie أو بونسو س Ponceau S. كوماسي هي الصبغة الأكثر حساسية من الصبغتين، بالرغم من أن سهولة ذوبان بونسو س في الماء تجعله أسهل للإزالة لاحقاً والتحقق من الغشاء كما في أدناه.
Towbin H, Staehelin T, Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets procedure and some applications < >Proc  Natl  Acad  Sci  U  S  A, 1979 Sep 76(9) 4350-4. PMID   388439] [http //www.pnas.org/cgi/content/abstract/76/9/4350 abstract




السد


بما أنه تم اختيار الغشاء لقابليته على الالتصاق بالبروتينات، وكلاً من الأجسام المضادة والأهداف هما بروتينات، يجب إتخاذ إجراءات خاصة لمنع التفاعلات بين الغشاء والجسم المضاد المستخدم لاكتشاف البروتين الهدف. يتم سد الالتصاق غير المحدد عن طريق وضع الغشاء في محلول مخفف من بروتين - عادة ما يكون هذا البروتين هو ألبومين مصل البقر Bovine Serum Albumin المعروف بالـ BSA أو حليب من غير دهون (كلاهما ليسا مكلفان)، مع مقدار صغير من منظف مثل توين 20 Tween. البروتين في المحلول المخفف يلتصق بالغشاء في كل الأماكن الغير محتوية على البروتينات الهدف. وبهذا، عندما يتم إضافة الجسم المضاد، لن يكون هناك مكان له ليلتصق غير على مواقع الالتصاق على البروتين الهدف المحدد. هذا يقلل التشويش في النتيجة النهائية للطخة ويسترن، ويؤدي إلى نتائج أوضح، ويقضي على النتائج الإيجابية المزيفة.


الاكتشاف


خلال عملية الاكتشاف، يتم التحقق من وجود البروتين المطلوب على الغشاء عن طريق جسم مضاد معدل مرتبط بإنزيم مراسل، الذي عند وضع مادة معينة عليه يسبب تفاعل لوني ويقوم بإنتاج لون معين. ولعدة أسباب، فإن هذه الخطوة تتم بخطوتين، بالرغم من أن الآن يوجد طرق اكتشاف ذات خطوة واحدة لبعض الاستخدامات.


الخطوتين


  • الجسم المضاد الأولي


  • يتم تكوين الأجسام المضادة عندما يتم عرض البروتين المطلوب (أو جزءاً منه) على المستضيف أو خلايا المناعة المزروعة. عادةً، يكون هذا جزءاً من الاستجابة المناعية، ولكن هنا يتم حصد الأجسام المضادة واستخدامها كأدوات اكتشاف دقيقة وحساسة تلتصق بالبروتين مباشرة.


    بعد عملية السد، يتم احتضان الغشاء في محلول مخفف من الجسم المضاد الأولي (عادة بتركيز بين 0,5 ميكروغرام /مل إلى 5 ميكروغرام/مل) مع التحريك الخفيف. بشكله النموذجي، يحتوي المحلول على محاليل ملحية مع نسبة صغيرة من المنظفات، وأحياناً مسحوق حليب أو ألبومين مصل البقر BSA. يمكن وضع محلول الجسم المضاد والغشاء معاً واحتضانهما لأي فترة بين 30 دقيقة إلى عبر الليل. ويمكن أيضاً احتضانهما في درجات حرارة مختلفة، حيث تكون الدرجات الدافئة أكثر محفزة على الالتصاق (لكلا نوعي الالتصاق، الالتصاق المحدد والالتصاق الغير محدد التشويش ).


  • الجسم المضاد الثانوي


  • بعد تنقيع الغشاء أو غسله لإزالة الأجسام المضادة الأولية الغير ملتصقة، يتم إضافة جسم مضاد آخر للغشاء، موجه نحو جزء خاص-لنوع species-specific الجسم المضاد الأولي. وهذا يعرف بالجسم المضاد الثانوي، وبسبب خواصه المستهدِفة، يتم تسميته بـ ضد-الفأر ، ضد-العنز ، ضد-الجرذ ، الخ. الأجسام المضادة تأتي من مصادر الحيوانات (أو زراعة خلايا هيبريدوما حيوانية)؛ فالجسم المضاد الثانوي ضد-الفأر سيلتصق لأي جسم مضاد أولي مصدره الفأر. وهذا يسمح لتوفير المصاريف بالسماح لكل المختبر من استخدام مصدر واحد من جسم مضاد منتج بكثرة، ويوفر نتائج منسقة أكثر بكثير. عادة ما يكون الجسم المضاد الثانوي مرتبط بجزيئة بايوتين أو إلى إنزيم مراسل مثل فسفاتاز قلوي Alkaline phosphatase أو بيروكسيداز الفجل الحار Horseradish peroxidase. هذا يعني أن عدة أجسام مضادة ثانوية ستلتصق بجسم مضاد أولي واحد وتقوم بتعزيز الإشارة للاكتشاف.

    image Western Blot binding.png


    غالباً ما يتم استخدام جسم مضاد ثانوي مرتبط ب بيروكسيداز الفجل مع عامل مضيء كيميائي، وينتج التفاعل بينهما ضوءاً بمقدار كمية البروتين. يتم استخدام طبقة حساسة من الفيلم الفوتوغرافي لخلق صورة للأجسام المضادة الملتصقة باللطخة.


    كما في إجراءات إيلايزا الإيلايزا إيلايزبوت الإيلايزبوت ، يمكن تزويد الأنزيم بجزيئة التي يحولها الإنزيم إلى ناتج تفاعل ملون يمكن رؤيته على الغشاء.


    البديل الثالث هو استخدام علامة مشعة بدل إنزيم متصل بالجسم المضاد الثانوي، مثل ربط بروتين يلتصق بالأجسام المضادة (مثل بروتين أ من العنقودية Staphylococcus) نظير بنظير مشع من يود اليود . ولكن بما أنه الطرق الأخرى هي أكثر أماناً، وأسرع وأرخص، قلّ ما يتم استخدام هذه الطريقة الآن.


    الخطوة الواحدة


    تأريخياً، كانت عملية التحقق تُجرى بخطوتين وذلك بسبب السهولة النسبية لإنتاج أجسام مضادة أولية وثانوية من ناحية المرونة، وأيضاً يضيف خطوة تكبير للإشارة لعملية الاكتشاف.


    نظراً للقدرة الإنتاجية العالية لتحليل البروتينات وانخفاض حدود الإشارة المطلوبة للكشف، تم تطوير طرق تحقُّق ذات خطوة واحدة والتي تستطيع أن تحدث بصورة أسرع مع تقليل استخدام المستهلكات. وهذا يتطلب جسم مضاد ملتقط الذي يتعرف على البروتين المطلوب ويحتوي على علامات اكتشاف/التقاط، وغالباً ما يكون هناك ملتقطات بروتينات مؤشرة للبروتينات المؤشرة Protein tags. يتم احتضان الملتقط الأولي مع الغشاء بطريقة مشابهة للجسم المضاد الأولي في طريقة الخطوتين، ومن ثم يكون جاهز للكشف بعد سلسلة من خطوات الغسل.


    Blotautoradiogram.png frame لطخة ويسترن باستخدام طريقة الاكتشاف المشع


    التحليل


    بعد أن يتم غسل الملتقطات الغير ملتصقة، تصبح لطخة ويسترن جاهزة للاكتشاف عن طريق الملتقطات الملتصقة بالبروتين المراد اكتشاف وجوده أو عدمه. في المصطلحات العملية، لا تُظهر كل لطخات ويسترن البروتين بصورة حزمة واحدة فقط على الغشاء.

    يتم أخذ تقديرات الحجم عن طريق مقارنة الحزم المكتشفة بحزم الدرج المصبوغة التي تم تحميلها عند خطوة الفصل الكهربائي. يتم إعادة هذه العملية لبروتين هيكلي، مثل الأكتين أو التيوبيولين، الذي لا يجب تغيير تركيزه بين العينات. كمية البروتين الموجودة تتم مقارنتها بالبروتين الهيكلي لكي يتم السيطرة على المجموعات العدة. هذه الطريقة تؤكد تصحيح التغييرات الدارجة بسبب عدم انتقال البروتين أو وجود أخطاء في التجربة.


    الاكتشاف اللوني Colorimetric detection


    طريقة الاكتشاف اللوني تعتمد على احتضان لطخة ويسترن مع المادة التي ستتفاعل مع الإنزيم المراسل (مثل بيروكسيداز البيروكسيداز Peroxidase) الذي يكون مرتبط بالجسم المضاد الثانوي. هذا يحول الصبغة الذائبة إلى شكل غير ذائب بلون مختلف والتي تترسب قرب الإنزيم وبالتالي تصبغ غشاء النيتروسيليلوز. يتم إيقاف تحميض اللطخة عندها عن طريق غسل الصبغة الذائبة. يتم تحليل كمية البروتينات باستخدام قياس الكثافة densitometry (أي ما هي كثافة البقعة/الصبغة) أو قياس الضوء spectrophotometry.


    الإضاءة الكيميائية Ch iluminescence




    تعتمد طريقة الاكتشاف بالإضاءة الكيميائية على احتضان لطخة ويسترن مع المادة التي تضيء عندما تتصل بالجزيء المراسل على الجسم المضاد الثانوي. وعندها يتم التقاط الضوء باستخدام فيلم فوتوغرافي ، ومؤخراً باستخدام كاميرات سي سي دي CCD cameras تلتقط صورة رقمية للطخة ويسترن. هذه الصورة يتم تحليلها باستخدام مقياس الكثافة الذي يحلل كمية الصبغة البروتينية النسبية ويقوم بالتحليل الكمي عن طريق الكثافة الضوئية. يوجد برامج جديدة تساعد على تحليلات البيانات بصورة أخرى مثل تحليل الوزن الجزيئي إذا تم استخدام مقاييس صحيحة. يعتبر ما يسمى ب المضيء الكيميائي المحسن Enhanced ch iluminscent أو ECL هو من ضمن أكثر الطرق حساسية للاكتشاف التحليلي للطخة ويسترن.


    image Western blot ch iluminescent detection.png



    الاكتشاف المشع Radioactive detection


    العلامات المشعة لا تحتاج إلى مواد إنزيمية، ولكن فقط وضع أفلام أشعة سينية طبية مباشرة على لطخة ويسترن والذي يقوم بخلق أجزاء غامقة على الفيلم تعود إلى حزم البروتينات المطلوب كشفها (انظر الصورة). قلت أهمية طرق الاكتشاف المشع، بسبب كونها مكلفة، ولها أخطار صحية عالية، كما أن المضيء الكيميائي المحسن ECL يعتبر بدل مفيد جداً.


    الاكتشاف الفلوري Fluorescent detection


    يتم تحفيز الملتقط ذو العلامات الفلورية بواسطة الضوء والانبعاث من التحفيز وبذلك يتم الاستدلال عليه بواسطة متحسس ضوئي مثل كاميرا سي سي دي المزودة بمرشح باعث مناسب حيث يقوم بألتقاط الصورة الرقمية للطخة ويسترن ويقوم بالسماح لتحليل بيانات أخرى كالوزن الجزيئي والتحليل الكمي للطخة ويسترن. يعتبر الملتقط الفلوري من بين أكثر الطُرق حساسية لتحليل اللطخة.


    التحقق الثانوي


    أحد الاختلافات الكبيرة بين غشائي النيتروسيليلوز و PVDF يعود إلى قابلية كل منهم على القيام بـ تعرية للأجسام المضادة وإعادة الاستخدام لأجسام مضادة ملتقطة لاحقاً. وبالرغم من أن هناك طرق مختبرة لتعرية أغشية النيتروسيليلوز، تظل أغشية الـPVDF أسهل تعرية، وتسهل استخدام أكثر قبل أن يقوم التشويش الخلفي بإعاقة التجارب. أحد الاختلافات الأخرى هو، بعكس النيتروسيليلوز، الـPVDF يجب أن ينقع في 95 إيثانول، بروبانول أو ميثانول قبل الاستخدام. أغشية الـPVDF أيضاً تكون أكثر سمكاً وأكثر مقاومة للضرر خلال الاستخدام.


    الفصل الكهربائي للهلام ببعدين


    2D-SDS-PAGE ثنائي الأبعاد يستعمل المبادئ والتقنيات المُشار إليها اعلاه. كما يشير الاسم، فإن هذه الطريقة تشمل هجرة سلسلة البروتينات في بعدين. في البُعد الأول تقوم السلسلة البروتينية بالأنفصال حسب نقطة التعادل الكهربي. أما في البعد الثاني تنفصل السلسلة البروتينية حسب وزنها الجزيئي. تُقاس نقطة التعادل الكهربي لبروتين مُعين بواسطة الرقم النسبي للأحماض الأمينية الموجبة (ك لايسين اللايسين ) والسالبة (ك جلوتاميت الجلوتاميت ), وتقوم الأحماض الأمينية السالبة بتزويد أعلى نقطة تعادل كهربي, ومن جهة أخرى تقوم الأحماض الامينية الموجبة بتزويد أقل نقطة تعادل كهربي.


    تسمح هذه الطريقة بفصل كل البروتينات الخلوية على هلام مفرد وكبير. من الفوائد المهمة لهذه الطريقة هي التمييز بين الأشكال المُختلفة لبروتين مُعين (مثلاَ البروتين الذي تمت فسفرتهُ، أي إضافة المجموعة السالبة الشُحنة). يُمكن قطع البروتين الذي تم فَصله من الهُلام وبعدها يتم تحليله بواسطة جهاز تحليل الكتلة mass spectrometry الذي يقوم باكتشاف البروتين وتحديد هويته.


    الاستخدامات في الفحص الطبي




    • إحدى اختيارات اختبار HIV الكشف على فيروس نقص المناعة البشرية توظف لطخة ويسترن لاكتشاف الجسم المضاد للفيروس HIV في عينة مصل الإنسان. بروتينات من خلايا معروفة الإصابة بفيروس HIV يتم فصلها وبقعها على غشاء كما في أعلاه. ثم، يتم تجربة المصل بصورة جسم مضاد أولي؛ ثم يتم غسل الأجسام المضادة غير الملتصقة، ويتم وضع جسم مضاد ثانوي ضد-بشري مرتبط بإنزيم الإشارة. الحزم المصبوغة تدل على البروتينات التي تتعرف عليها الأجسام المضادة في مصل المريض.

    • يتم أيضاً استخدام لطخة ويسترن كاختيار مؤكد لمرض جنون البقر (Bovine spongiform encephalopathy (BSE.

    • يتم استخدام لطخة ويسترن لاختيار بعض أنواع مرض لايم Lyme disease (الذي هو التهاب بكتيري).



    الطرق


  • طريقة مختبر الدكتور مارك بارتون فرانك


  • Western Blot.png تصغير لطخة ويسترن

    في تقانة حيوية التقنيات الحيوية ، لطخة ويسترن إنج Western Blot (تعرف أيضا باللطخة المناعية Immunoblot) هي طريقة اكتشاف بروتين معين في عينة أو مستخلص أنسجة، وهي من التقنيات الحيوية المخبرية. تستخدم الفصل الكهربائي للهلام لفصل البروتينات الطبيعية native proteins أو بروتين مفكك البروتينات المُتَمَسِّخة denatured proteins حسب طول السلاسل البروتينية (ظروف مفككة) أو حسب الشكل الثلاثي الأبعاد للبروتين (ظروف قومية/غير مفككة). يتم، في ما بعد، نقل البروتينات إلى غشاء (عادة ما يكون الغشاء مصنوعا من مادة نيتروسيليلوز النيتروسيليلوز أو PVDF )، حيث يتم التحقق (الاكتشاف) باستخدام أضداد مخصصة للبروتين الهدف. هناك الآن العديد من شركات المواد التي تتخصص في تجهيز أضداد (مستنسخة ومتعددة النسائل) ضد آلاف البروتينات المختلفة. وقد قام هذا بتقليل الوقت الذي تحتاجه لعمل لطخة بصورة كبيرة.



    كان يجب، سابقًا، تلقيح الحيوانات الكبيرة (مثل خروف الخرفان ، عنز العنز - يحتويان على الكثير من مصل المصل ) بالبروتين المستهدف مرتين (حيث أن الاستجابة المناعية الثانية تنتج أضدادا أكثر). ومن ثم إما يتم تصفية المصل واستخدامه (أضداد متعددة النسائل - Polyclonal -) أو يمكن فصل الخلايا البائية من الحيوان ودمجها خارج الجسم < >in vitro مع خلايا فأر سرطان سرطانية لتوليد خلايا هيبريدوما التي تستطيع في ما بعد إنتاج أضداد وحيدة النسيلة (Monoclonal).



    الأضداد التجارية عادة ما تكون مكلفة، ولكن يمكن إعادة استخدامها (استخدام ما يتبقى من الأجسام المضادة غير الملتصقة) بين التجارب. هذه الطريقة تستخدم في الأحياء الجزيئية ، الكيمياء الحيوية ، و علم الجينات المناعية Immunogenetics وعدة أخرى من علوم الأحياء الجزيئية.


    من التقنيات الأخرى المتعلقة هي استخدام الأجسام المضادة لاكتشاف البروتينات في الأنسجة أو الخلايا باستخدام صبغة مناعية الصبغة المناعية Immunostaining و إلايزا الإلايزا ELISA.


    تم صنع هذه الطريقة في مختبر جورج ستارك في جامعة ستانفورد عام 1981. قام وولتر نيل بورنيت بتسميتها باسم لطخة ويسترن ، Cite journal
    author W. Neal Burnette

    'Western blotting' electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate — polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A

    journal Anal Bioch


    year 1981

    month April

    volume 112

    issue 2

    pages 195-203



    PMID   6266278] [http //dx.doi.org/10.1016/0003-2697(81)90281-5 doi 10.1016/0003-2697(81)90281-5
    Citation's Classic Burnette



    وهو مشتق من اسم لطخة جنوبية اللطخة الجنوبية (Southern Blot لغة إنكليزية بالإنكليزية ، من Southern وهي نسبة إلى إدون ساذرن Edwin Southern، والتي تعني أيضا الجنوبي لغة إنكليزية بالإنكليزية . فسميت التقنية الجديدة بـويسترن، تلاعبا بالمعنى). و لطخة جنوبية اللطخة الجنوبية تقنية لاكتشاف حمن الحمض الريبي النووي منقوص الأكسجين DNA، قام إدون ساذرن Edwin Southern بصنعها عام 1975. تسمى طريقة اكتشاف حرن الحمض الريبي النووي RNA باسم لطخة شمالية اللطخة الشمالية .

     
    التعليقات (1 تعليق)

    (اضيف قبل 7 شهر و 11 يوم)
    تبليغ عن اساءة

    انسخ الارقام تحتهم


    زائر     طلب حذف التعليق
    مفيد جداً
     


    اعلانات
    تصنيفات الموقع
    شاهد الجديد لهذه المواقع
    أخبار السعودية اليوم الاحد 18/02/2018 - أخبار قطر اليوم الاحد 18/02/2018 - أخبار الإمارات اليوم الاحد 18/02/2018 - أخبار الكويت اليوم الاحد 18/02/2018 - أخبار السياحة اليوم الاحد 18/02/2018 - أخبار البحرين اليوم الاحد 18/02/2018 - أخبار المغرب اليوم الاحد 18/02/2018 - أخبار الاردن اليوم الاحد 18/02/2018 - أخبار فلسطين اليوم الاحد 18/02/2018 - أخبار عمان اليوم الاحد 18/02/2018 - أخبار لبنان اليوم الاحد 18/02/2018 - أخبار السودان اليوم الاحد 18/02/2018 - أخبار الكورة اليوم الاحد 18/02/2018 - اعلانات الحراج اليوم الاحد 18/02/2018 - اسعار السيارات بالكويت الاحد 18/02/2018 - اسعار العقارات بالكويت الاحد 18/02/2018