أعلانات الحراج مستودعات للايجار بالسلي - المنطاد الرومنسي الطائر - فرصة عمل - Moving shifting paking carpentry labour truck&pickup service - مطبعة اعلانات و خطاط / كافة اللوحات الاعلانية ( البسيط للتصميم - Luxury Studio Apartment behind Land Mark Mall - Maid required for 1 month - ستوديو مفروش في حي الخضراء تونس - بيع ركشات بالتقسيط - Translator translation ترجمة مترجم Eng/Arb/Arm/Tur - مكنسة AURA-ROBOCLEAN splus - شقة تمليك - مطلوب روت وايلر الااصلي او دوبر مان - استراحة للبيع 2200م بتاجوراء - سياره نيسان Z350 موديل 2006 - اراضي للبيع في قدامي المحاربين - عملة عثمانية.نارة و عرنصة - اسكفاري محل كما في صوره - منزل نظيف دورين في شارع الصريم للايجار - دمشق مهاجرين - مطلوب عطور زيتيه ومش زيتيه وبخور بشيك مصدق - فيلا للبيع في اربد - فستان زفاف "فيللو" تركي درجة أولى - ارض 990م2 للبيع في البتراوي - فرصة العمر - ارض سكني ( د ) تبعد عن دوار سال 150 م - سير كهربائي شبه جديد للبيع بسعر مغري جدا - شقه 80 م سوبر لوكس بمطروح - لدي رخصة قيادة كويتية وسيارة ومعرفة بأعمال الشؤون والجوازات ومعرفة بمناطق الكويت - للبيع خل بلدي 100% - ميتسوبيشي كانتر اللبيع موديل 89 بحاله جيده للبيع - للايجار فلا فى غرب الجليب - A/C Technician+drive - اريد كامرة كانون الاحترافية 650D - مقاول بشيك مصدق(طرابلس فقط) - A new blomberg dryer 7kg..not used - سوداني يبحث عن عمل مقيم في صلالة - باص سوزوكي زلومة فتش - طروف نيسان الميرا مرش مسطوريات اي قطع غير موجوده - مطعم للبيع 120م بالمعادى - Awesome copper plates - بلي 3 سلم للبيع - صبغة الشعر (عشبة باربي) - منزل للبيع بي جنزور الرشاح - زينقو جديد - متشي 2010 - بيع بيت - خامات صابون سلفونيك تكسابون خروع جلسرين تايلوز وكل ماتحتاجونه في عالم صناعه الم - تنسيق الحدائق بارقا الطرق العالميه - شقة في عرمون حي القبة شارع فينيسيا -
موقع الو سلطان الخنه - سلطان الخنه - ام نوره (ممرخه ) - دكتوره نبيله - د. هاني السرجاني - سمير الحاسب الآلي - محمود تويوتا - ابومعن بيت - عبدالله حسن دعبوب - السيف ماركتينج - محمد سعيد دعبوب الكودي - ابوجمال 7 - الكودي - شيميل المهبوله ريم - حسن الحارس - بقالة فيصل - سوبر ماركت النشمى - بقالة ابو ظبي بلازا - ابوريان7 - محمد سمير. بقالة الفرسان توصيل - روزه - فلاح - شاي ساره العجمي للتنحيف - البندري - الشيخ/ خالد البلطان رئيس الشباب - Nabil Qashou - نايف الوثلان - رينبو المحصل - د عمرو مستوصف سلامات - بدر1 - Z.NAUF AJME - ام فهد وسميه بيت - م فهد الشهيل مكتب بقعاء - يوسف البنجالي البيت المحمي الزراعي - وسيم الحلاق - محمد عبده - سعيد القحطاني مكتب الامير محمد بن ناصر - ام صالح تعالج - يبغي دخون الساعه 9 - طارق جواد - محامي ابو عمر - سايق سكاريا - فيصل حامد - سوريه د/تغريد حمود غدد صماء - مطعم ام نواف - مسمكه جمعيه المنصوريه داخل السوق محمد صديق - NP97258886 - كربلاء فندق الشارقه احمد - شيميل شيميل - فندق سكس حلو دبي -
الجديد شركة القُصير السعودية لتأجير وبيع الخيـام الأوروبية ومولدات الكهرباء - أفضل طريقة لعلاج أمـراض الشـرج - الغوالي - عطر فاخر في المملكة العربية السعودية - r for data science - الصلاة الصلاة - كيف ازرع النعناع في المنزل ؟ - فوائد التمر والحليب - كيف توفر العديد من المال على نفسك ؟ -
آخر المشاهدات هاتف وعنوان المستشفى الوطني - الملز, مدينة الرياض - توافق نفسي أنواع التوافق النفسي - هاتف وعنوان مطاعم لبنان الاخضر - سيهات, الدمام - هواتف مكتب الضمان الاجتماعى ب أبها ومعلومات عنها بالسعودية - طريقة عمل حلى الكريمه الصفراء بطعم لذيذ - [نسائيات] تعريف الاجهاض المنسي , علاج الاجهاض المنسي - منوعات مفيدة - هاتف وعنوان مستوصف سلامات - حائل - الغراب (فيلم) حادثة مقتل براندون لي - عبد الله بن فودي اسمه ونسبه - قائمة شخصيات ون بيس القراصنة - هواتف مكتب الضمان الاجتماعى بالمدينة المنورة ومعلومات عنها بالسعودية - هواتف مكتب الضمان الاجتماعى بحائل ومعلومات عنها بالسعودية - وصفة من الاعشاب لعلاج مرض الشرى (الارتيكاريا) - كلية ابن سينا رسوم الكلية - مساعد بن عبد الرحمن بن فيصل آل سعود إخوانه - أرقام طوارئ الكهرباء بالمملكة العربية السعودية - هاتف وعنوان مطعم موفق - السلامه, جدة - قائمة حلقات بليتش قائمة الحلقات - ميزانية و تكاليف ودراسة جدوى مشروع استخلاص الزيوت العطرية والطبية - هواتف مستشفى ابن سيناء بحداء و معلومات عنها فى مكة المكرمة بالسعودية - بانشي (مسلسل) القصة - طريقة تحضير يلنجي او ورق عنب بالزيت من الشيف منال العالم - قاعدة سمبسون استنتاج القاعدة - هاتف وعنوان المستوصف النموذجي الطبي - النظيم, مدينة الرياض - الجديد فى علاج دوالي الخصية - طريقة عمل الجبن الابيض الدوبل كريم بالمنزل - هاتف وعنوان مستوصف العروبة الطبي - الشفا, مدينة الرياض - مغامرات زينة ونحول الشخصيات - وصفة هائلة من الطب البديل لعلاج الروماتيزم أمراض العظام والمفاصل بالاعشاب - هاتف وعنوان الكركند للمأكولات البحرية - خميس مشيط, عسير - طريقة عمل البصارة بالملوخية مثل المطاعم - طريقة عمل كبسة الربيان الناشف بطريقتي المطوره - طارق الحماد - شخصيات مسلسل زمن البرغوت شخصيات المسلسل - هاتف وعنوان مطاعم حراء - الصفا, جدة - لمقصود بوجود كيس ماء أو أكياس الماء في الأذن الوسطى عند الأطفال - فاني هيل - طريقة عمل صينية السمك بالحمر من حلقات برنامج منال العالم - طريقة تحضير حلو خفيف وسريع التحضير - طريقة عمل المعدس اكله كويتيه معروفه لا تفوتك - وصفة هائلة من الطب البديل لعلاج القولون بالاعشاب - ليز تايلر - طريقة عمل طبخة صيادية السمك والأرز البني من مطبخ منال العالم - نشيد اليمن الوطني كلمات النشيد الرسمية - [بحث جاهز للطباعة] مشروع تخرج نظم معلومات , مشروع تخرج شبكات - - اختبار بيوريت كاشف بيوريت - كبرياء وتحامل (رواية) ملخص الأحداث - عنوان وهواتف سفارة اليمن فى السعودية ومعلوات عنها - هنري فايول إنجازات - البوابة التاسعة (فيلم) القصة - طريقة عمل تشيكن برجر منزلي لا تفوتك - مرض الشعاف عند الاطفال ، الاسباب والعلاج وطرق الوقاية - كسر (رياضيات) أنواع الكسور - جاسم يعقوب حياته العائلية - سور القران لكل شهر من شهور الحمل - وصفة لعلاج التهاب المثانة ومشاكل المجاري البولية بالاعشاب الطبيعية - حسن اللول (فيلم) قصة فيلم - ما هو مرض تورمات فاجنر او واغنر؟ - طريقة عمل الشراغيف (اكله شعبيه - نبيذ أنواع النبيذ - [بحث جاهز للطباعة] خاتمة بحث ديني علمي عربي قصيره - - قياس الكالبروتكتين في البراز البنية والوظيفة - يا حلوة مع السلامة (أغنية) Bella Ciao - نواضر الأيك في معرفة النيك خلاف حول مؤلف الكتاب - هاتف مركز المعابدة الصحي بمكة المكرمة و معلومات عنه بالسعودية - جص الصيغة الكيميائية للجبس - أسباب التوقف المفاجئ لوظائف الكليه - قائمة المشاريع العملاقة تعريفات - جاذبية قاتلة (فيلم) بطولة - دينا شهابي الرصيد - سرطان البروستاتا الأعراض - هاتف وعنوان محل العطوي لبيع الغاز - تبوك - طريقة علاج الشرخ الشرجي في اسبوع واحد بإذن الله - [تطوير الذات] موسوعة ( هل تعلم ) بين أيديكم .. - موسوعة التنمية البشرية - وصفة هائلة من الطب البديل لعلاج مشاكل الدوره الشهرية و الحيض بالاعشاب - مكافآت طلاب مدارس تحفيظ القرآن الكريم بالمملكة العربية السعودية - طريقة تحضير الكانيلوني من الشيف منال العالم - نجاسة تعريف النجاسة وأنواعها - مولان (فيلم 1998) أسماء مؤدو اصوات الشخصيات - قائمة شخصيات مسلسل الزير سالم قاءمة الممثلين - تثبيت النيتروجين التثبيت الحيوي للنيتروجين - نموذج قرار الشركاء بتعديل عقد تأسيس شركة ذات مسؤولية محدودة لوفاة أحد الشركابالسعودية - مرض نسيج ضام غير متمايز - عامل التغذية العصبية المستمد من الدماغ روابط خارجية - هاتف وعنوان مستشفى الشفاء الطبي - المنصور, مكة المكرمة - هاتف وعنوان مستشفى الملك فهد الجامعي - الخبر شمال, مدينة الخبر - طريقة عمل الميكاتو بطعم لذيذ - إعراب محلي مواضع الإعراب المحلي - مملكة المسبعات الموقع - وصفة هائلة من الطب البديل لعلاج النتؤات او الثؤلول او الثلول بالاعشاب - ترخان خديجة سلطان نيابة السلطنة - هاتف وعنوان مستوصف المغلوث الطبي - المبرز, الاحساء - هاتف وعنوان مستشفى الملك فهد - ابو عريش, جازان - [طب بديل ] العلاج ببول الابل - مواضيع صحية - خاصية مكثفة وخاصية شمولية خواص مكثفة - استشارة طبية : متى يخرج الطفل الخديج من الحضانة بعد الولادة ؟ - هجرة الخن الجديد السكان - وصفة تساعد على التئام الجروح: بسرعة بخلطات الاعشاب - وصفات تعمل بالمنزل - خليف بن دواس وفاته - مشهور بن مساعد بن عبد العزيز آل سعود أسرته - هاتف وعنوان مطعم شيخ المندي - رأس تنوره, الدمام - هواتف مكتب الضمان الاجتماعى بالخرج ومعلومات عنها بالسعودية - هواتف مستشفى الملك فهد و معلومات عنها فى بجــــــازان بالسعودية - هاتف وعنوان شركة شمسان الصهيبي وابناؤه - النزله, جدة - طريقة تحضير مقلوبة السمك من الشيف منال العالم - هاتف وعنوان أبراج الخالدية مركز الخزان - المربع, مدينة الرياض - هاتف وعنوان استوديو سعيد للتصوير - صفوي, الدمام - غزو الاحباش لليمن مقدمة - أفضل مائة رواية حسب دار مودرن لايبراري قائمة المحررين (أعظم روايات القرن العشرين) - خواص العلاقات على المجموعة أولا خاصية الانعكاس - الطمحة (قبيلة) نسبهم - إصابة الجهاز التناسلي للمرأة بالدرن - فيزا عمل للسعودية ,, شروط واجراءات استخراجها - هاتف وعنوان محل قلعة الصخور للأحجار الكريمة - الصفا, جدة - مناخ الجزائر خصائص المناخ في الجزائر - هاتف وعنوان مستوصف الهلال الفضي - الخبر, مدينة الخبر - ميزانية و تكاليف ودراسة جدوى مشروع تصنيع المخللات - إتمام إجراءات زواج السعودي من أجنبية بعد وصول الموافقة فى الاردن - لانا القسوس حياتها الشخصية - هواتف و عناوين وزارة الخارجية - الرياض بالمملكة العربية السعودية - اتش بريدج - عنوان و هواتف القنصلية السعودية فى لوس أنجلوس ومعلومات شاملة عنها - ايهما افضل تربية الدجاج في البطاريات ام على الارض - استشارة قانونية حول اجراءات الطلاق طبقا للقانون الكويتي - هواتف و معلومات عن جوازات مطار الملك عبد العزيز بالسعودية - منشار أنواع المناشير - هاتف وعنوان مطعم ماضينا - الخبر, مدينة الخبر - هواتف مجموعة محمد منصور البسامي للتجارة والمقاولات ومعلومات عنها بالسعودية - رجيم الدكتور قاسم الجوهرى يخسس 12 كيلو في شهر - عبد اللطيف الهميم أهم مؤلفاته - بابوا الغربية جزر المقاطعة - كلية الاقتصاد في جامعة حلب - مسار الانظمة/الرياض طابعات امنية سنترالات كاميرات انذار حريق جي بي اس - هواتف الخطوط الجوية العربية السعودية في المملكة المغربية - مسدس صوت تحويل المسدس الصوت الي مسدس حي - اسباب وجود كيس دهني على الرحم وطرق العلاج - هاتف وعنوان مشتل وردة الشفاء - الشفا, مدينة الرياض - هاتف وعنوان مستوصف البركة - محايل, عسير - يوسف غصوب دواوين الشاعر - نموذج محضر ضبط مخالفات نظام حماية المرافق العامة والتحقيق فيها بالسعودية - وصفة هائلة من الطب البديل لعلاج الإسهال والقيء بالاعشاب - دراسة جدوى مفصلة لمشروع صناعة المنتجات الجلدية - مالتيتول الانتاج والاستخدام - مناخ كير - هاتف وعنوان مستوصف ركن العلاج لطب وتقويم الأسنان - الشفا, مدينة الرياض - شروط نقل ملكية المؤسسات بالتنازل أو البيع بالسعودية - وصفة هائلة من الطب البديل لعلاج التهاب الحنجره التهاب الحلق بالاعشاب - جواز سفر إثيوبي شروط جواز السفر الجديد - تصوير ومضي التصوير الومضاني لعضو أو لمجموعة الأعضاء - طريقة تحضير القراقيش المصريه من الشيف منال العالم - لاموتريجين الاعراض الجانبية - بدر مولى عبد الرحمن الداخل نبذة وتعريف - جدول مقارنة الخيوط الجراحية - وصفة هائلة من الطب البديل لعلاج سلس البول والغائط بالاعشاب - هيئة الشؤون المالية للقوات المسلحة (مصر) رؤساء الهيئة - اسباب صغر حجم القضيب عند الأطفال micropenis - السيف والرقعة الحاسمة قصة الدراما - طريقة عمل سـاتي الدجـاج بطعم لذيذ لا تفوتك - كوهيرانس (فيلم) القصة - وصفة لعلاج التهاب المفاصل و آلام العضلات بخلطات الاعشاب - وصفات تعمل بالمنزل - هاتف وعنوان مكتب الزهير للإستقدام - خميس مشيط, عسير - [بحث جاهز للطباعة] قائمة بعناوين مشاريع التخرج لتخصص الرياضيات - - هاتف وعنوان مستشفى الأزهار - النسيم, مدينة الرياض - مختار أبو غالي - عنوان وهواتف سفارة بنجلاديش فى السعودية ومعلوات عنها - ما هو مرض الجليجل الذى يصيب العين ؟ - هاتف وعنوان مستوصف حامد التخصصي - محايل, عسير - قط نيبيلونج - طريقة عمل طبخة القدره الخليليه من مطبخ منال العالم - إدوارد سي تولمان - دراسة جدوى تفصيلية لمشروع تعبئة وتغليف المواد غذائيه - هاتف وعنوان شركة الردادي للمطاعم البحرية - الحره الشرقيه, المدينة المنورة - العلاج الفعال لمرض جرثومة المعدة ونصائح طبية للمرضى - سيانيد الزنك الخواص - اعشاب لحرق الدهون فى الجسم للتخسيس و النحافه - طريقة عمل ومقادير الفاصوليا الخضراء من مطبخ منال العالم - هاتف و معلومات عن مطعم لو كروسان بالمدينة المنورة - عبد الله بن فيصل بن تركي الأول آل سعود الحالة الاجتماعية - نظائر الهيدروجين هيدروجين-1 (بروتيوم) - ألم عصبي قذالي الأسباب - هاتف وعنوان مطعم مشويات لبنان - تبوك - سبارتاكوس (مسلسل) القصة - هاتف وعنوان مؤسسة سعيد علي الغامدي للإستقدام - باب مكه, جدة - [بحث جاهز للطباعة] بحث عن حرب 6 اكتوبر 1973 بالصور pdf doc - - هواتف مكتب الضمان الاجتماعى بتبوك ومعلومات عنها بالسعودية - النوم في العسل (فيلم) قصة الفيلم - هاتف وعنوان مستوصف أبها الوطني - ابها - طريقة تحضير إنجلش كيك على طريقة منال العالم خطوة بخطوة - هل مرض بطانة الرحم المهاجرة تسبب عدم الانجاب؟ - هواتف مؤسسة المهذل للمقاولات العامة ومعلومات عنها بالسعودية - متلازمة السرج الخالي السبب - [طب بديل ] خطوات علاج مرض الذئبة الحمراء بالاعشاب الطبية - مواضيع صحية - طريقة عمل طبخة دجاج محشى بالارز من مطبخ منال العالم - هاتف وعنوان النهاري للأختام - الطائف المركزي, الطائف - طريقة عمل البطاطس والبروكلي بالجبن وصفة رمضانية لذيذة من منال العالم - هاتف وعنوان مستوصف مركز الرياض الطبي - شارع العروبة, مدينة الرياض - بني يشكر نسب بني يشكر - هاتف وعنوان مجمع الرياض الطبي - الشميسي, مدينة الرياض - المحقق كونان (الموسم 24) عناوين الحلقات - هاتف وعنوان عدنان صبغة للأعشاب الطبيعية - مكه الخريق, مكة المكرمة -
اليوم: الاربعاء 26 سبتمبر 2018 , الساعة: 6:30 ص / اسعار صرف العملات ليوم الاربعاء 26/09/2018


اعلانات
محرك البحث


لطخة ويسترن خطوات لطخة ويسترن

نشر قبل 2 سنة 324 مشاهدة


اعلانات
شاركنا رأيك بالموضوع

خطوات لطخة ويسترن


تحضير الأنسجة



يمكن أخذ العينات من أنسجة كاملة أو من زراعة الخلايا. يتم كسر الأنسجة الصلبة ميكانيكيًا، في أغلب الأحيان، باستخدام خلاّط (لإحجام عينات كبيرة)، باستخدام مجنس homogenizer (للأحجام الأصغر)، أو الصوتنة بالصوتنة Sonication. يمكن كسر وفتح الخلايا بإحدى الطرق المذكورة أعلاه أيضًا.


يمكن توظيف العديد من المنظفات والأملاح والمحاليل لتشجيع التكسر الخلوي ولإذابة البروتينات. يتم أيضًا إضافة مثبطات (موانع) البروتييزات والفسفاتازات Protease and Phosphatase Inhibitors وذلك لمنع تآكل العينة بإنزيماتها الخاصة.


يتم استخدام مجموعة من التقنيات الميكانيكية والكيمياحيوية (البايوكيميائية) من ضمنها أيضًا العديد من أنواع التصفية و طرد مركزي الطرد المركزي لفصل أجزاء أو عضيات معينة من الخلايا.


image SDS-PAGE sample.png


الفصل الكهربائي للهلام


مفصلة فصل كهربائي للهلام


يتم فصل بروتينات العينة باستخدام فصل كهربائي الفصل الكهربائي . فصل البروتينات قد يكون باستخدام النقطة متوازنة الكهربة Isoelectric point (pI)، الوزن الجزيئي، الشحنة الكهربائية، أو مجموعة من هذه العوامل. طبيعة الفصل تعتمد على طريقة معالجة العينة وطبيعة الهلام.


إلى حد الآن، الطريقة الأكثر شيوعاً للفصل الكهربائي للهلام توظف هلامات متعدد الأكريلامايد polyacrylamide ومحاليل تحتوي على كبريتات دوديكل الصوديوم Sodium Dodecyl Sulfate (SDS).


SDS-PAGE أي (الفصل الكهربائي لهلام كبريتات دوديكل الصوديوم متعددالأكريلامايد SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis) تحافظ على سلسلة البروتيات في حالة مفككة denatured state حالماً يتم معالجتهم مع عوامل اختزال قوية للقضاء على الأشكال الثانوية والثالثية. (مثل تحويل الروابط ثنائية الكبريت S-S إلى SH و SH) وبذلك يسمح لفصل البروتينات حسب وزنهم الجزيئي. يتم تغطية البروتينات في العينة بكبريتات دوديكل الصوديوم السالبة الشحنة ونقلها إلى القطب الكهربائي الموجب الشحنة خلال شبكة الأكريلامايد في الهلام.

البروتينات الصغيرة تهاجر أسرع خلال هذه الشبكة وبذلك يتم فصل البروتينات حسب الحجم (عادة ما يتم قياسها بالكيلودالتون، kD، kiloDaltons). تركيز الأكريلامايد يحدد دقة الهلام - كلما زاد تركيز الأكريلامايد كلما زادت دقة البروتينات ذات الأوزان الجزيئية العالية. البروتينات تهاجر ببعد واحد خلال الهلام لأغلب اللطخات.

image SDS-PAGE Electrophoresis.png


WB-gel الهلام ويلاحظ فيه الدرج بصورة حزم زرقاء اللون بسبب الصبغة الزرقاء كوماسي بلو Coomassie Blue

يتم تحميل العينات في < >آبار في الهلام. يتم حفظ إحدي الأسطر للـ < >درج أو < >العلامات، وهما خليط متوفر تجارياً من عدة بروتينات معروفة الوزن الجزيئي، عادة ما تكون مصبوغة لكي تُظهر حزم ملونة مرئية.


أحد الأمثلة على الدرج، هو درج الأوزان الجزيئية الكامل المدى لشركة GE (كما في الشكل). عندما يتم تطبيق فرق الجهد على الهلام، تهاجر البروتينات ضمنه بسرع مختلفة. هذه المعدلات الزمنية المختلفة للتقدم ( حركة فصل كهربائي حركات الفصل الكهربائي المختلفة) تُفصل إلى < >حُزم ضم كل < >سطر.



من الممكن أيضاً استخدام هلام ثنائي الأبعاد الفصل الكهربائي ثنائي الأبعاد الذي يفصل البروتينات من عينة واحدة في بُعدين. البروتينات تفصل بحسب النقطة متوازنة الكهربة (تركيز أيونات الهيدروجين pH الذي تكون فيه الشحنة متعادلة) في البعد الأول، وبحسب الوزن الجزيئي في البعد الثاني.


النقل



من أجل جعل الوصول للبروتينات أسهل للاكتشاف بالأجسام المضادة، يتم نقلهم من الهلام إلى غشاء مصنوع من النيتروسيليوز أو الـPVDF. يتم وضع هذا الغشاء فوق الهلام، ووضع مجموعة من طبقات أوراق الترشيح فوق ذلك. ثم يتم وضع الطبقات كلها في محلول يقوم بالتنقل إلى الأعلى عبر الأوراق بالخاصية الشعرية Capillary action، جالباً البروتينات معه إلى الغشاء.


ومن الطرق الأخرى لنقل البروتينات تدعى اللطخة الكهربائية وتستخدم تياراً كهربائي لسحب البروتينات من الهلام إلى الغشاء.


البروتينات الآن نُقلت من داخل الهلام إلى سطح غشاء من النيتروسيليلوز أو PVDF مع ثباء الترتيب التي كانت البروتينات عليه داخل الهلام. ويكون ناتج هذه العملية، هو عرض البروتينات على سطح رقيق للاكتشاف (انظر أسفلاً). كلا نوعي الغشاء (نيتروسيليلوز أو PVDF) يتم اختيارهم لخاصية الالتصاق غير المحدد بالبروتيات (أي أنهم يلتصقون بأي بروتين بصورة متساوية). التصاق البروتينات مبني على تفاعلات مصابة بفوبيا الماء hydrophobic interactions)، بالإضافة إلى التفاعلات المشحونة بين الغشاء والبروتين. إن أغشية النيتروسيليلوز تكون أقل كلفة من الـ PVDF، ولكنهم هشة أكثر ولا تستطيع الوقوف لتحقيقات مجددة reprobes كثيرة.Renart J, Reiser J, Stark GR. Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera a method for studying antibody specificity and antigen structure , < >Proc  Natl  Acad  Sci  U  S  A, 1979 Jul 76(7) 3116-20. PMID   91164] [http //www.pnas.org/cgi/content/abstract/76/7/3116 abstract




image Western blot transfer.png


التأثير الكلّي والموحّد لنقل البروتين من الهلام إلى الغشاء يمكن التأكد منه بصبغ الغشاء بصبغة كوماسي Coomassie أو بونسو س Ponceau S. كوماسي هي الصبغة الأكثر حساسية من الصبغتين، بالرغم من أن سهولة ذوبان بونسو س في الماء تجعله أسهل للإزالة لاحقاً والتحقق من الغشاء كما في أدناه.
Towbin H, Staehelin T, Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets procedure and some applications < >Proc  Natl  Acad  Sci  U  S  A, 1979 Sep 76(9) 4350-4. PMID   388439] [http //www.pnas.org/cgi/content/abstract/76/9/4350 abstract




السد


بما أنه تم اختيار الغشاء لقابليته على الالتصاق بالبروتينات، وكلاً من الأجسام المضادة والأهداف هما بروتينات، يجب إتخاذ إجراءات خاصة لمنع التفاعلات بين الغشاء والجسم المضاد المستخدم لاكتشاف البروتين الهدف. يتم سد الالتصاق غير المحدد عن طريق وضع الغشاء في محلول مخفف من بروتين - عادة ما يكون هذا البروتين هو ألبومين مصل البقر Bovine Serum Albumin المعروف بالـ BSA أو حليب من غير دهون (كلاهما ليسا مكلفان)، مع مقدار صغير من منظف مثل توين 20 Tween. البروتين في المحلول المخفف يلتصق بالغشاء في كل الأماكن الغير محتوية على البروتينات الهدف. وبهذا، عندما يتم إضافة الجسم المضاد، لن يكون هناك مكان له ليلتصق غير على مواقع الالتصاق على البروتين الهدف المحدد. هذا يقلل التشويش في النتيجة النهائية للطخة ويسترن، ويؤدي إلى نتائج أوضح، ويقضي على النتائج الإيجابية المزيفة.


الاكتشاف


خلال عملية الاكتشاف، يتم التحقق من وجود البروتين المطلوب على الغشاء عن طريق جسم مضاد معدل مرتبط بإنزيم مراسل، الذي عند وضع مادة معينة عليه يسبب تفاعل لوني ويقوم بإنتاج لون معين. ولعدة أسباب، فإن هذه الخطوة تتم بخطوتين، بالرغم من أن الآن يوجد طرق اكتشاف ذات خطوة واحدة لبعض الاستخدامات.


الخطوتين


  • الجسم المضاد الأولي


  • يتم تكوين الأجسام المضادة عندما يتم عرض البروتين المطلوب (أو جزءاً منه) على المستضيف أو خلايا المناعة المزروعة. عادةً، يكون هذا جزءاً من الاستجابة المناعية، ولكن هنا يتم حصد الأجسام المضادة واستخدامها كأدوات اكتشاف دقيقة وحساسة تلتصق بالبروتين مباشرة.


    بعد عملية السد، يتم احتضان الغشاء في محلول مخفف من الجسم المضاد الأولي (عادة بتركيز بين 0,5 ميكروغرام /مل إلى 5 ميكروغرام/مل) مع التحريك الخفيف. بشكله النموذجي، يحتوي المحلول على محاليل ملحية مع نسبة صغيرة من المنظفات، وأحياناً مسحوق حليب أو ألبومين مصل البقر BSA. يمكن وضع محلول الجسم المضاد والغشاء معاً واحتضانهما لأي فترة بين 30 دقيقة إلى عبر الليل. ويمكن أيضاً احتضانهما في درجات حرارة مختلفة، حيث تكون الدرجات الدافئة أكثر محفزة على الالتصاق (لكلا نوعي الالتصاق، الالتصاق المحدد والالتصاق الغير محدد التشويش ).


  • الجسم المضاد الثانوي


  • بعد تنقيع الغشاء أو غسله لإزالة الأجسام المضادة الأولية الغير ملتصقة، يتم إضافة جسم مضاد آخر للغشاء، موجه نحو جزء خاص-لنوع species-specific الجسم المضاد الأولي. وهذا يعرف بالجسم المضاد الثانوي، وبسبب خواصه المستهدِفة، يتم تسميته بـ ضد-الفأر ، ضد-العنز ، ضد-الجرذ ، الخ. الأجسام المضادة تأتي من مصادر الحيوانات (أو زراعة خلايا هيبريدوما حيوانية)؛ فالجسم المضاد الثانوي ضد-الفأر سيلتصق لأي جسم مضاد أولي مصدره الفأر. وهذا يسمح لتوفير المصاريف بالسماح لكل المختبر من استخدام مصدر واحد من جسم مضاد منتج بكثرة، ويوفر نتائج منسقة أكثر بكثير. عادة ما يكون الجسم المضاد الثانوي مرتبط بجزيئة بايوتين أو إلى إنزيم مراسل مثل فسفاتاز قلوي Alkaline phosphatase أو بيروكسيداز الفجل الحار Horseradish peroxidase. هذا يعني أن عدة أجسام مضادة ثانوية ستلتصق بجسم مضاد أولي واحد وتقوم بتعزيز الإشارة للاكتشاف.

    image Western Blot binding.png


    غالباً ما يتم استخدام جسم مضاد ثانوي مرتبط ب بيروكسيداز الفجل مع عامل مضيء كيميائي، وينتج التفاعل بينهما ضوءاً بمقدار كمية البروتين. يتم استخدام طبقة حساسة من الفيلم الفوتوغرافي لخلق صورة للأجسام المضادة الملتصقة باللطخة.


    كما في إجراءات إيلايزا الإيلايزا إيلايزبوت الإيلايزبوت ، يمكن تزويد الأنزيم بجزيئة التي يحولها الإنزيم إلى ناتج تفاعل ملون يمكن رؤيته على الغشاء.


    البديل الثالث هو استخدام علامة مشعة بدل إنزيم متصل بالجسم المضاد الثانوي، مثل ربط بروتين يلتصق بالأجسام المضادة (مثل بروتين أ من العنقودية Staphylococcus) نظير بنظير مشع من يود اليود . ولكن بما أنه الطرق الأخرى هي أكثر أماناً، وأسرع وأرخص، قلّ ما يتم استخدام هذه الطريقة الآن.


    الخطوة الواحدة


    تأريخياً، كانت عملية التحقق تُجرى بخطوتين وذلك بسبب السهولة النسبية لإنتاج أجسام مضادة أولية وثانوية من ناحية المرونة، وأيضاً يضيف خطوة تكبير للإشارة لعملية الاكتشاف.


    نظراً للقدرة الإنتاجية العالية لتحليل البروتينات وانخفاض حدود الإشارة المطلوبة للكشف، تم تطوير طرق تحقُّق ذات خطوة واحدة والتي تستطيع أن تحدث بصورة أسرع مع تقليل استخدام المستهلكات. وهذا يتطلب جسم مضاد ملتقط الذي يتعرف على البروتين المطلوب ويحتوي على علامات اكتشاف/التقاط، وغالباً ما يكون هناك ملتقطات بروتينات مؤشرة للبروتينات المؤشرة Protein tags. يتم احتضان الملتقط الأولي مع الغشاء بطريقة مشابهة للجسم المضاد الأولي في طريقة الخطوتين، ومن ثم يكون جاهز للكشف بعد سلسلة من خطوات الغسل.


    Blotautoradiogram.png frame لطخة ويسترن باستخدام طريقة الاكتشاف المشع


    التحليل


    بعد أن يتم غسل الملتقطات الغير ملتصقة، تصبح لطخة ويسترن جاهزة للاكتشاف عن طريق الملتقطات الملتصقة بالبروتين المراد اكتشاف وجوده أو عدمه. في المصطلحات العملية، لا تُظهر كل لطخات ويسترن البروتين بصورة حزمة واحدة فقط على الغشاء.

    يتم أخذ تقديرات الحجم عن طريق مقارنة الحزم المكتشفة بحزم الدرج المصبوغة التي تم تحميلها عند خطوة الفصل الكهربائي. يتم إعادة هذه العملية لبروتين هيكلي، مثل الأكتين أو التيوبيولين، الذي لا يجب تغيير تركيزه بين العينات. كمية البروتين الموجودة تتم مقارنتها بالبروتين الهيكلي لكي يتم السيطرة على المجموعات العدة. هذه الطريقة تؤكد تصحيح التغييرات الدارجة بسبب عدم انتقال البروتين أو وجود أخطاء في التجربة.


    الاكتشاف اللوني Colorimetric detection


    طريقة الاكتشاف اللوني تعتمد على احتضان لطخة ويسترن مع المادة التي ستتفاعل مع الإنزيم المراسل (مثل بيروكسيداز البيروكسيداز Peroxidase) الذي يكون مرتبط بالجسم المضاد الثانوي. هذا يحول الصبغة الذائبة إلى شكل غير ذائب بلون مختلف والتي تترسب قرب الإنزيم وبالتالي تصبغ غشاء النيتروسيليلوز. يتم إيقاف تحميض اللطخة عندها عن طريق غسل الصبغة الذائبة. يتم تحليل كمية البروتينات باستخدام قياس الكثافة densitometry (أي ما هي كثافة البقعة/الصبغة) أو قياس الضوء spectrophotometry.


    الإضاءة الكيميائية Ch iluminescence




    تعتمد طريقة الاكتشاف بالإضاءة الكيميائية على احتضان لطخة ويسترن مع المادة التي تضيء عندما تتصل بالجزيء المراسل على الجسم المضاد الثانوي. وعندها يتم التقاط الضوء باستخدام فيلم فوتوغرافي ، ومؤخراً باستخدام كاميرات سي سي دي CCD cameras تلتقط صورة رقمية للطخة ويسترن. هذه الصورة يتم تحليلها باستخدام مقياس الكثافة الذي يحلل كمية الصبغة البروتينية النسبية ويقوم بالتحليل الكمي عن طريق الكثافة الضوئية. يوجد برامج جديدة تساعد على تحليلات البيانات بصورة أخرى مثل تحليل الوزن الجزيئي إذا تم استخدام مقاييس صحيحة. يعتبر ما يسمى ب المضيء الكيميائي المحسن Enhanced ch iluminscent أو ECL هو من ضمن أكثر الطرق حساسية للاكتشاف التحليلي للطخة ويسترن.


    image Western blot ch iluminescent detection.png



    الاكتشاف المشع Radioactive detection


    العلامات المشعة لا تحتاج إلى مواد إنزيمية، ولكن فقط وضع أفلام أشعة سينية طبية مباشرة على لطخة ويسترن والذي يقوم بخلق أجزاء غامقة على الفيلم تعود إلى حزم البروتينات المطلوب كشفها (انظر الصورة). قلت أهمية طرق الاكتشاف المشع، بسبب كونها مكلفة، ولها أخطار صحية عالية، كما أن المضيء الكيميائي المحسن ECL يعتبر بدل مفيد جداً.


    الاكتشاف الفلوري Fluorescent detection


    يتم تحفيز الملتقط ذو العلامات الفلورية بواسطة الضوء والانبعاث من التحفيز وبذلك يتم الاستدلال عليه بواسطة متحسس ضوئي مثل كاميرا سي سي دي المزودة بمرشح باعث مناسب حيث يقوم بألتقاط الصورة الرقمية للطخة ويسترن ويقوم بالسماح لتحليل بيانات أخرى كالوزن الجزيئي والتحليل الكمي للطخة ويسترن. يعتبر الملتقط الفلوري من بين أكثر الطُرق حساسية لتحليل اللطخة.


    التحقق الثانوي


    أحد الاختلافات الكبيرة بين غشائي النيتروسيليلوز و PVDF يعود إلى قابلية كل منهم على القيام بـ تعرية للأجسام المضادة وإعادة الاستخدام لأجسام مضادة ملتقطة لاحقاً. وبالرغم من أن هناك طرق مختبرة لتعرية أغشية النيتروسيليلوز، تظل أغشية الـPVDF أسهل تعرية، وتسهل استخدام أكثر قبل أن يقوم التشويش الخلفي بإعاقة التجارب. أحد الاختلافات الأخرى هو، بعكس النيتروسيليلوز، الـPVDF يجب أن ينقع في 95 إيثانول، بروبانول أو ميثانول قبل الاستخدام. أغشية الـPVDF أيضاً تكون أكثر سمكاً وأكثر مقاومة للضرر خلال الاستخدام.


    الفصل الكهربائي للهلام ببعدين


    2D-SDS-PAGE ثنائي الأبعاد يستعمل المبادئ والتقنيات المُشار إليها اعلاه. كما يشير الاسم، فإن هذه الطريقة تشمل هجرة سلسلة البروتينات في بعدين. في البُعد الأول تقوم السلسلة البروتينية بالأنفصال حسب نقطة التعادل الكهربي. أما في البعد الثاني تنفصل السلسلة البروتينية حسب وزنها الجزيئي. تُقاس نقطة التعادل الكهربي لبروتين مُعين بواسطة الرقم النسبي للأحماض الأمينية الموجبة (ك لايسين اللايسين ) والسالبة (ك جلوتاميت الجلوتاميت ), وتقوم الأحماض الأمينية السالبة بتزويد أعلى نقطة تعادل كهربي, ومن جهة أخرى تقوم الأحماض الامينية الموجبة بتزويد أقل نقطة تعادل كهربي.


    تسمح هذه الطريقة بفصل كل البروتينات الخلوية على هلام مفرد وكبير. من الفوائد المهمة لهذه الطريقة هي التمييز بين الأشكال المُختلفة لبروتين مُعين (مثلاَ البروتين الذي تمت فسفرتهُ، أي إضافة المجموعة السالبة الشُحنة). يُمكن قطع البروتين الذي تم فَصله من الهُلام وبعدها يتم تحليله بواسطة جهاز تحليل الكتلة mass spectrometry الذي يقوم باكتشاف البروتين وتحديد هويته.


    الاستخدامات في الفحص الطبي




    الطرق


  • طريقة مختبر الدكتور مارك بارتون فرانك


  • Western Blot.png تصغير لطخة ويسترن

    في تقانة حيوية التقنيات الحيوية ، لطخة ويسترن إنج Western Blot (تعرف أيضا باللطخة المناعية Immunoblot) هي طريقة اكتشاف بروتين معين في عينة أو مستخلص أنسجة، وهي من التقنيات الحيوية المخبرية. تستخدم الفصل الكهربائي للهلام لفصل البروتينات الطبيعية native proteins أو بروتين مفكك البروتينات المُتَمَسِّخة denatured proteins حسب طول السلاسل البروتينية (ظروف مفككة) أو حسب الشكل الثلاثي الأبعاد للبروتين (ظروف قومية/غير مفككة). يتم، في ما بعد، نقل البروتينات إلى غشاء (عادة ما يكون الغشاء مصنوعا من مادة نيتروسيليلوز النيتروسيليلوز أو PVDF )، حيث يتم التحقق (الاكتشاف) باستخدام أضداد مخصصة للبروتين الهدف. هناك الآن العديد من شركات المواد التي تتخصص في تجهيز أضداد (مستنسخة ومتعددة النسائل) ضد آلاف البروتينات المختلفة. وقد قام هذا بتقليل الوقت الذي تحتاجه لعمل لطخة بصورة كبيرة.



    كان يجب، سابقًا، تلقيح الحيوانات الكبيرة (مثل خروف الخرفان ، عنز العنز - يحتويان على الكثير من مصل المصل ) بالبروتين المستهدف مرتين (حيث أن الاستجابة المناعية الثانية تنتج أضدادا أكثر). ومن ثم إما يتم تصفية المصل واستخدامه (أضداد متعددة النسائل - Polyclonal -) أو يمكن فصل الخلايا البائية من الحيوان ودمجها خارج الجسم < >in vitro مع خلايا فأر سرطان سرطانية لتوليد خلايا هيبريدوما التي تستطيع في ما بعد إنتاج أضداد وحيدة النسيلة (Monoclonal).



    الأضداد التجارية عادة ما تكون مكلفة، ولكن يمكن إعادة استخدامها (استخدام ما يتبقى من الأجسام المضادة غير الملتصقة) بين التجارب. هذه الطريقة تستخدم في الأحياء الجزيئية ، الكيمياء الحيوية ، و علم الجينات المناعية Immunogenetics وعدة أخرى من علوم الأحياء الجزيئية.


    من التقنيات الأخرى المتعلقة هي استخدام الأجسام المضادة لاكتشاف البروتينات في الأنسجة أو الخلايا باستخدام صبغة مناعية الصبغة المناعية Immunostaining و إلايزا الإلايزا ELISA.


    تم صنع هذه الطريقة في مختبر جورج ستارك في جامعة ستانفورد عام 1981. قام وولتر نيل بورنيت بتسميتها باسم لطخة ويسترن ، Cite journal
    author W. Neal Burnette

    'Western blotting' electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate — polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A

    journal Anal Bioch


    year 1981

    month April

    volume 112

    issue 2

    pages 195-203



    PMID   6266278] [http //dx.doi.org/10.1016/0003-2697(81)90281-5 doi 10.1016/0003-2697(81)90281-5
    Citation's Classic Burnette



    وهو مشتق من اسم لطخة جنوبية اللطخة الجنوبية (Southern Blot لغة إنكليزية بالإنكليزية ، من Southern وهي نسبة إلى إدون ساذرن Edwin Southern، والتي تعني أيضا الجنوبي لغة إنكليزية بالإنكليزية . فسميت التقنية الجديدة بـويسترن، تلاعبا بالمعنى). و لطخة جنوبية اللطخة الجنوبية تقنية لاكتشاف حمن الحمض الريبي النووي منقوص الأكسجين DNA، قام إدون ساذرن Edwin Southern بصنعها عام 1975. تسمى طريقة اكتشاف حرن الحمض الريبي النووي RNA باسم لطخة شمالية اللطخة الشمالية .

     
    التعليقات (1 تعليق)

    (اضيف قبل 1 سنة و 2 شهر)
    تبليغ عن اساءة

    انسخ الارقام تحتهم


    زائر     طلب حذف التعليق
    مفيد جداً
     


    اعلانات
    تصنيفات الموقع
    شاهد الجديد لهذه المواقع
    بئر السبع ميسوكسيمايد تل هشومير المرجة الزرقاء أسامة بن زيد الغاف دراسة جدوى خطة عمل روبرك الطاقة الداخلية مذكرات دورية نحو الشرق ايو جيما العياضي برباس العياضي شركة مكافحة حشرات خوارزمية ديكسترا مرفأ بيروت الكايد طاش ما طاش شركة كايد البسقلون كورونا سد حراض الفن البيزنطي عبد السلام بنعبد العالي رائد عودة مستشفى طيبة التخصصي غزوة خيبر شركة فواز لعامة للدراسات والمستندات كلوفيس الأول لمع قطع الغيار جميل خطاب ويلان نظم المعلومات المحاسبية محمود بن محمود البان باقادر مؤسسة بن شيهون الصحة الحقن المجهري الصين معلمات معلومات اتجاه البطولي أرضروم تنافسية شكاوي محمد الحاج سالم تكرلي مبرهنة عدم الاكتمال علاج عرق النسا موقع سنهدريم التكامل العددي كهربا الحكومة الحكومة التونسية مسالك بولية معاهدة فاليتا مستشفي بدر مشاغل مراكز التجميل محمد حافظ الشريدة وديع سعادة مشغل جرافيزم شكا الربان حديقة التجارة نقليات الهباس بن دعجم بطباط حمود بوعلام حميدة معركة ثابسوس براتا البن الاخضر مشروع تخرج الزكاه ديدفورت تاريخ فواصل الكتب توسعة المسجد النبوي نادي الفتح telnet 1978 عصبام اللوزتين سبيكمان 213 الاقتصاد رمادي عادي فندق العليا تشويه سمعه اسماك الأسماك مؤسسة
    أخبار السعودية اليوم الاربعاء 26/09/2018 - أخبار قطر اليوم الاربعاء 26/09/2018 - أخبار الإمارات اليوم الاربعاء 26/09/2018 - أخبار الكويت اليوم الاربعاء 26/09/2018 - أخبار السياحة اليوم الاربعاء 26/09/2018 - أخبار البحرين اليوم الاربعاء 26/09/2018 - أخبار المغرب اليوم الاربعاء 26/09/2018 - أخبار الاردن اليوم الاربعاء 26/09/2018 - أخبار فلسطين اليوم الاربعاء 26/09/2018 - أخبار عمان اليوم الاربعاء 26/09/2018 - أخبار لبنان اليوم الاربعاء 26/09/2018 - أخبار السودان اليوم الاربعاء 26/09/2018 - أخبار الكورة اليوم الاربعاء 26/09/2018 - اعلانات الحراج اليوم الاربعاء 26/09/2018 - اسعار السيارات بالكويت الاربعاء 26/09/2018 - اسعار العقارات بالكويت الاربعاء 26/09/2018