نشر قبل 1 سنة و 6 شهر	116 مشاهدة
اضافة تعليق إضافة صورة هل هنالك خطأ بهذا المحتوى ؟

الخطوات

تحسين التفاعل

يتم في بداية الامر ادخال شريط DNA المراد مسخه مع البادئ (primers) وكذلك بوجود انزيم DNA polymerase والقواعد النتروجينه في انوبة صغيره تسمى eppender tube وتمر بثلاث مراحل متتالية

1. مرحلة المسخ او التفكك وتحدث في درجة حرارة بين 94-98 م حيث يبدأ شريط DNA بالانقسام إلى خيطين منفصلين عن بعض وتحدث خلال فترة زمنية بين 1 - 9 دقائق


2. مرحلة الالتصاق وفي هذه المرحلة يبدأ البادئ بالاتصاق على خيط DNA وتتم بدرجة حراريه اقل من مرحلة التفكك 50 - 65 ° س، وتتم تقريباً خلال ظ¥ ثواني


3. مرحلة التمدد او البناء تعد هذه المرحلة الاخيرة في عملية المسخ وتحدث في درجة 75–80 °س، وهذه هي الدرجة الحرارية المناسبة لعمل الانزيم DNA polymerase لتقوم ببناء خيط الحامض النووي الجديد

هذه المراحل الثلاث تعتبر دوره واحد يصبح فيها الحامض قد تضاعف إلى نسختين ، ان اساس مبدأ عمل ال PCR هو الاعتماد على الدورة الحرارية التي تستخدم الديناميكا الحرارية من تفاعلات الحمض النووي عن طريق تناوب التسخين والتبريد لعينات ال PCR بعد تحديد درجات الحرارة . وهذه العملية تمكن من فصل فرعي الحمض النووي الحلزوني المزدوج في درجة حرارة عالية (DNA melting) وتحت درجات الحرارة المنخفضة فان كل فرع من حمض نووي ريبوزي منقوص الأكسجين الحمض النووي يستخدم بواسطة انزيمات بلمرة الحمض النووي لانتاج تركيب جديد كامل منه. كل دورة من PCR تضم ثلاث عمليات مختلفة في دورة درجة الحرارة (( t perature cycling اولا التمسخ (denaturation) او تذويب الحمض النووي حيث يفصل ال DNA الي قطعتين (ssDNA) من خلال كسر الرابطة الهيدروجينية بين ازواج القواعد . تعتبر هذه الخطوة قصيرة لانها تحتاج ما بين 10 ثانية و 30 ثانية في 92 درجة مئوية إلى 96 درجة مئوية . اما الخطوة الثانية الصلب ( annealing) يتم صلب ال DNA الاولي لانتاج سلاسل مكملة ل (ssDNA) من خلال تشكيل رابطة هيدروجينية روابط هيدروجينية بالتالي ينتج اثنين من dsDNA جديد وهذه الاجزاء القصيرة تؤدي في نهايتها الي تشكيل الحمض النووي الجديد . اما الخطوة الثالثة الاستطالة (elongation) وتسمى ايضا التكرار الانزيمي يتم فيها اتحاد ايونات موجبة كعامل محفز والكمية المطلوبة من مكملة ال deoxynucleotides (dNTPs) . وانزيم بلمرة ال DNAيبدا بتكرار ال DNA في الموقع التمهيدي . وتستمر هذه العمليات باعادة تسخين ال dsDNA وفصله مرة اخرى .في كل دورة PCR يزداد جزء الحمض النووي زيادة أسية وفقا لاللأس 2 (يعني ان الواحد يصبح اثنان والاثنان اربعة ثم ثمانية…) .بما ان هذه العملية تستخدم لتضخيم الحمض النووي فان من 35 الى 40 دورة نحتاجها لتقديم ما يكفي من عينة ال DNAللتحليل .


بحتاج بوليمر الحمض النووي الى محفز على شكل كيتون كيتونات ثنائية التكافؤ وهي اما مغنسيوم المغنيسيوم او منغنيز المنغنيز . تستخدم هذه المحفزات ايضا كعامل مساعد في تفاعل البوليمرات المتسلسل . التركيز الطببيعي للمنغنيز هو 2.5 مايكرومتر . المشعلات هي أليغونيوكليوتايد (في PCR، وتستخدم أزواج التمهيدي) التي تمت إضافتها على شكل قطع مصنعة صغيرة من حمض نووي ريبوزي منقوص الأكسجين الحمض النووي والتي تحتوي على متتاليات مكملة للمنطقة المستهدفة لجزيء الحمض النووي المستهدف. المشعلات تصلب للجزء النهائي من التسلسل المستهدف ليتم تضخيمها. هذه المشعلات هي المكونات الرئيسية للتضخيم الانتقائي و المكرر لقطع الحمض النووي المستهدفة ضمن مجموعة من الأحماض النووية, و هي عادة ما تتكون من 20-25 من القواعد الطويلة, و ما لا يزيد عن 30 قاعدة طويلة. وتستخدم مجموعة معينة من المشعلات لتضخيم ناتج واحد من تفاعل البلمرة المتسلسل. واحدة من المشعلات يصلب إلى حبلا في الأمام والأخرى إلى الحبل العكسي من جزيئات الحمض النووي خلال خطوة الصلب. المشعلات انفسهم يتم تصنيعهم و تجميعهم غالبا من Phosphoramidites نيوكليوزيد مفرد, بطريقة تسلسل معين. هذه المشعلات بالتالي ترتبط بسهولة بالحمض النووي المكتمل والخاص بها, أو بجدائل الحمض النووي الريبي في تسلسل محدد, لتشكيل الدوبلكس, أو أقل في كثير من الأحيان, الهجينة لمرتبة أعلى. على هذا النحو، المشعلات لازمة لبدء تركيب الحمض النووي, وبالتالي فانها تسمح لبوليميريز الحمض النووي لتمديد أليغنوكليوتيد و تكرار حبلا التكميلية. بوليمبريزالحمض النووي يبدأ التكرار في 3'-نهاية التمهيدي، ويكمل حبلا المعاكس. والتمهيدي( المشعل) مع درجة الحرارة الصلب أعلى بكثير من درجة حرارة التفاعل الصلب مع درجة الحرارة الصلب أعلى بكثير من درجة حرارة التفاعل الصلب يمكن أن تفوت-hybridise وتمدد حمض نووي ريبوزي منقوص الأكسجين الحمض النووي في مكان غير صحيح على طول تسلسل الحمض النووي ، بينما عند درجة حرارة أقل بكثير من درجة حرارة الصلب، يمكن أن تفشل حمض نووي ريبوزي منقوص الأكسجين الحمض النووي ليصلب ويتوسع على الإطلاق. تحتاج متواليات المشعل ( التمهيدي ) أيضا أن يتم اختياره لتحديد فريد لمنطقة من الحمض النووي، وتجنب إمكانية تفويت-تهجين لتسلسل مماثل قريب. وهكذا صممت هذه البادئات باستخدام أدوات محددة، مثل برنامج التمهيدي اكسبرس (الحياة تكنولوجيز، كارلسباد، الولايات المتحدة الأمريكية)، أو غيرها. وهناك طريقة شائعة الاستخدام في تصميم التمهيدي تنطوي على بحث الانفجار, الذي هو أداة بحث في قاعدة بيانات بنك الجينات , حيث وينظر إلى كل من المناطق المحتملة التي يمكن للتمهيدي ( المشعل ) الربط بها. أيضا ينبغي تجنب تكرار في المشعلات, لأن تشكل حلقة قد يحدث, و التي يمكن أن تسهم في تفويت التهجين.

مرجع كتاب
المؤلف1 Dr Patricia Hernandez-Rodriguez

العنوان Polymerase Chain Reaction

الطبعة

الصفحة

سنة

الناشر intechopen

الرقم المعياري 978-953-51-0612-8

تاريخ الوصول 30, May,

المكان

اللغة الإنكليزية

العنوان بالعربي تفاعل البوليميراز المتسلسل

المبادئ الكمية لتفاعل البولميرات المتسلسل

على مر السنوات القليلة الماضية ؛ تمت عملية تطوير الادوات والاجهزة التي ادت الى الى توسيع نطاق تفاعل البوليمرات المتسلسل الذي تمكن من الكشف عن منتوجات ال(Q-PCR / QRT) والذي يعرف ايضا باسم (PCR (QPCR وهذا الجهاز الذي يعتبر من اكثر الاجهزه نفوذا في عالم علم الأحياء الجزيئي البيولوجيا الجزئية . وبالنسبة لهذه المتواليات المحددة داخل حمض نووي ريبوزي منقوص الأكسجين الحمض النووي أوالتي تعمل كقالب [ يمكن نسخها، أو تضخيم ، بما يصل الى عدة آلاف من أمثالها او ما يصل الى مليون من الاضعاف في التقليدية PCR،كما يستخدم PCR للكشف الكمي والنوعي لتسلسل تضخيمها للوقت الحقيقي وهوه (QPCR). كما ينطوي على تحليل PCR بعد ان يتم (الهلام الكهربائي وتحليل الصور على النحو الوارد اعلاه) ففي هذه العملية يتم قياس كمية النتج من PCR في كل دورة. وهذه القدرة على رصد رد الفعل خلال مرحلته الاسية تمكن المستخدم من تحديد المبلغ الاولي للهدف بدقة كبيرة . كما ان الكمية يمكن ان تكون اما العدد المطلق للنسخ او الكمية القريبة وعندما تطبع لادخال الحمض النووي او الجينات تطبع تطبييع اضافي.

المكونات الاساسية في قياس PCR، والاختلافات الوحيدة هي في كشف (مضان صبغ) الذي يعمل على تضخيم الهدف،وشرط لمنصة أجهزة معينة. تتكون أجهزة QPCR من دائري حراري، جهاز كمبيوتر، والبصريات لمضان

الإثارة وجمع الانبعاثات (أ مقياس التألق)، والحصول على البيانات وتحليل البرمجيات. ويمكن الكشف عن الهدف المتضخم بطريقتين مختلفتين الأولى، مع دون تحديد الأصباغ الفلورية أن يقحم مع أي dsDNA. والثانية، مع تسلسل محدد تحقيقات حمض نووي ريبوزي منقوص الأكسجين الحمض النووي التي تتكون من أليغنوكليوتيد] التي وصفت مع صبغة الفلور الصبغة التي تسمح بظهور الشكل، وبالتالي يتم الكشف عنه، إلا أن الحمض النووي الذي يحتوي هدف التسلسل. مع استخدام فلوري غير محدد الأصباغ زيادة في QPCR المنتج خلال QPCR يؤدي إلى زيادة في كثافة مضان التي تقاس في كل دورة، مما يسمح لتراكيز dsDNA ليكون كميا. ومع ذلك، إذا كان تحديد من QPCR محدودة حيث أن هذه الأصباغ وربط كل من dsDNA المنتجة داخل وQPCR. والأصباغ الفلورية وبالتالي غير محددة تقيس ليس فقط QPCR المطلوب المنتجات، ولكن أيضا منتجات PCR غير محددة (بما في ذلك dimers التمهيدي على سبيل المثال).

هذا يمكن ان يؤدي الى تداخل ، أو منع التقدير الدقيق للهدف المقصود (تسلسل). والكشف الأكثر تحديدا الممكن هوه استخدام اختبار حمض نووي ريبوزي منقوص الأكسجين الحمض النووي DNAذا تسلسل معين، والذي فقط يكشف عن تسلسل الحمض النووي الهدف. استخدام هذه التحقيقات يؤدي الى زيادة كبيرة في خصوصية الكشف وحساسية الطريقة، وكما يسمح هذا الكم حتى في وجود تضخيم الحمض النووي غير محدد.

المجموعة المتنوعة من التحقيقات المختلفة تستخدم الآن (جزيئية المنارة، عقرب التحقيق، وغيرها)، على الرغم من أن تلك هي الطرق الأكثر شيوعا المستخدمة الا انه يوجد ايضا التحقيقات المائية (تحقيقات TAQMAN) وهوه المسمى مسبار المائي مع مراسل فلوري في نهاية 5' ومع جزيء يعرف باسم 'فاكهه تقضي في دورته الطرف المقابل. عند التحقيق السليم، وعلى مقربة من مراسل و فاكهه تقضي يمنع الكشف عن مضان المراسل. هذا التبريد لمراسل مضان من قبل فاكهه تقضي يحدث من خلال عملية الرنين مضان لنقل الطاقة. كما ان حصيلة تفاعل PCR، خلال المرحلة الصلبة، الاشعال والتحقيق في التهجين إلى شريطا ssDNA مكملة ومراسل المضان يبقى مطفأ. بدء التالية من بلمرة الحمض النووي الجديد شريطان من الاشعال، بوليميريز الحامض النووي ثم يصل التحقيق لهاعند 5'-3'-

النشاط الانوية الخارجية يحط التحقيق.

وبعد انبعاث المصدرالمنفصل يمكن بعد ذلك ان يتم الكشف عن المراسل الفلوري بعد الإثارة مع المصدر المناسب لضوء، مما يؤدي إلى زيادة في مضان. وتجدر الإشارة الى ان التحقيقات مختلفة في التسميات بسبب ان مضان الصبغة يمكن استخدامها في فحوصات متعددة للكشف عن العديد من الأحماض النووية في رد فعل QPCR واحد.

لفهم فوائد QPCR، لمحة عامة عن أساسيات PCR الضرورية.

في بداية رد فعل PCR، الكواشف هي الإفراط في القالب وتراكيز الكافية للمنتجات هي في أدنى مستوى ولاستعادة الطبيعة للمنتج فلا يجب التنافس مع التمهيدي الملزم، وعائدات التضخيم في الثابت الأسي ومعدل.

النقطة التي معدل التفاعل يتوقف عن أن يكون الأسي ويدخل مرحلة خطية من التضخيم هي المتغير العالي، حتى بين العينات تتكرر. ثم، في دورة لاحقة، والتضخيم يتم كقطرات معدل الصفر القريب (تصل إلى القمة)، وأكثر من ذلك بقليل المنتج PCR. لتصل للدقة المتناهية، فإنه من الضروري جمع البيانات الكمية في النقطة التي كل عينة في مرحلة الأسي من التضخيم. وتحليل ردود الأفعال خلال المرحلة الأسية في عدد الدورات المعينة ينبغي أن توفر نظريا عدة أوامر من حجم النطاق الديناميكي، والتي تكون عادة 5-9 أوامر من الحجم الكمي. مضان من المنتجات PCR لكل عينة في كل دورة يتم الكشف عنه ويقاس في جهاز QPCR، وزيادة للهندسية لها أن يتوافق معه.

يتم استخدام الزيادة الهائلة للمنتج لتحديد دورة العتبة في كل رد فعل. ويعتبر هذا مضان التي تم جمعها عن رد فعل إيجابي QPCR في الواقع بمثابة عملية التضخيم السيني، حيث يتم رسم مضان في عدد من الدورات.وأجزاء مختلفة من منحنيات التضخيم مهمة. يمثل الأساس ليتم طرح مستوى الضوضاء في الدورات الاولى، وهذا من مضان الحصول عليها من منتجات PCR. العتبة هو المستوى الذي يتم تعديله لقيمة أعلى من خط الأساس الذي يجب أن يكون موجودا في المرحلة الأسية من عملية التضخيم، ودورة عتبة (CT) هو الدورة التي مؤامرة التضخيم يعبر عتبة . منحنى قياسي يمكن استخلاصها من التخفيفات لتسلسل من عينة إيجابية.

هناك العديد من التطبيقات لQPCR. وهي تستخدم عادة لكلا الأساسية والبحث و التشخيص. يستخدم التشخيص QPCR للكشف عن سرعة الأحماض النووية التي تستخدم في التشخيص، على سبيل المثال، الأمراض المعدية، وأمراض السرطان او تشوهات وراثية.

مرجع كتاب
المؤلف Dr Patricia Hernandez-Rodriguez

العنوان Polymerase Chain Reaction

الطبعة

الصفحة

سنة

الناشر intechopen

الرقم المعياري 978-953-51-0612-8

تاريخ الوصول 30, May,

المكان

اللغة الإنكليزية

العنوان بالعربي تفاعل البوليميراز المتسلسل

تثبيط تفاعل البلمرة المتسلسل

يمكن تحديد استخدام النسخ العكسي لتفاعل البلمرةالمتسلسل التقليدي باستخدام مثبطات التفاعل البلمرة المتسلسل. هذا هو الحال بشكل خاص عندما يتم تطبيق تقنيات مباشرة لعينات بيولوجية معقدة للكشف عن الكائنات الحية الدقيقة، مثل السريرية والبيئية وعينات المواد الغذائية .مثبطات تفاعل البلمرة المتسلسل يمكن أن تنشأ من العينة نفسها أو كنتيجة للطريقة التي استخدمت لجمع أو تحضير العينة . وفي كلتا الحالتين، يمكن للمثبطات الحد بشكل كبير من الحساسية وتوسيع كفاءة تفاعل البلمرة المتسلسل. تثبيط النسخ العكسي لتفاعل البلمرة المتسلسل يعرض استفسارات إضافية ، بما ان اختلافات طفيفة في فعالية التضخيم بين العينات يمكن أن تؤثر بشكل كبير على دقة تقدير قالب النسخ .

أنواع مثبطات تفاعل البلمرة المتسلسل

عينات المواد الغذائية تنتج بعض المشاكل الرئيسية المرتبطة باستخدام فحوصات تفاعل البلمرة المتسلسل نظراً لمختلف مثبطاته التي يمكن العثور عليها في هذه العينات. من ناحية أخرى ، فإنه لا بد من توفير طريقة لديها بروتوكول مرن يمكن تطبيقه على العديد من أنواع الأنسجة الغشائية لإزالة هذه المواد المثبطة بفاعلية والتي تتداخل مع توسيع تفاعل البوليميرازالمتسلسل . ويمكن لمثبطات تفاعل البلمرة المتسلسل أن تنشأ من العينة الأصلية أو من تحضير العينة مسبقاً قبل تفاعل البلمرة المتسلسل . يمكن تثبيط تفاعل البلمرة المتسلسل عن طريق تحديد فعالية إنزيم بلمرة الحمض النووي( الثابت بالحرارة)،و تحطيم أو القبض على حمض نووي الأحماض النووية ، و التدخل في تحلل الخلايا.

النتائج السلبية الخاطئة يمكن أيضا أن تحدث بسبب تحلل تسلسل حمض نووي ريبوزي منقوص الأكسجين الحمض النووي المستهدف في العينة. يمكن للمشكلة أن تزيد مع عزل البكتيريا أو الحمض النووي البكتيري مباشرةً من الأنسجة الغشائية للمواد الغذائية ،مع عدم وجود بروتوكول لتحضير عينة واحدة عرف بالعمل من أجل كل تطبيق . عندما يكون الهدف من تفاعل البوليميرازالمتسلسل هو الكائنات الحية الدقيقة، هناك خطوة تخصيب يمكن تضمينها إذا كانت الكائنات الدقيقة موجودة بأعداد قليلة جدا، على الرغم من أن معظم مرق التخصيب وأوساط الآغار الانتقائية تحتوي على مواد تثبط تفاعل البوليميرازالمتسلسل. الخطوة المهمة هي غسل الخلايا التي تم جمعها من التخصيب أو وسط الآغار بواسطة تكويرهم باستخدام طرد مركزي الطرد المركزي ، وإزالة الطافي منها ، وإعادة تعليق الخلايا في المياه المالحة أو المياه لاستخراج حمض نووي ريبوزي منقوص الأكسجين الحمض النووي . تطبيق بروتوكول إعداد جيد للعينة سوف يركز على تجميع البكتيريا، إزالة المثبطات الكامنة في المواد الغذائية و أوساط التنبيت، و تركيز الحمض النووي المستخرج . من المهم ذكر أنه تم العثور على مثبطات تفاعل البلمرة المتسلسل في جميع أنواع المواد الغذائية، بما في ذلك اللحوم والحليب والأجبان والتوابل.

وتشمل هذه المواد كلوريد الصوديوم NaCl، كلوريد البوتاسيوم KCl، منظفات أيونية مثل deoxycholate الصوديوم، sarkosyl، كبريتات الصوديوم دوديسيل، و إيثانول الإيثانول ، الأيزوبروبانول، الفينول، زيلين، cyanol، وبرموفينول الأزرق.
عندما يشتبه بتثبيط تفاعل البوليميرازالمتسلسل، أبسط مسار للعمل هو تمييع القالب (وبالتالي أيضا أي مثبطات)، والاستفادة من حساسية تفاعل البلمرة المتسلسل PCR.

التثبيط هو مشكلة في العديد من تطبيقات تفاعل البوليميرازالمتسلسل PCR، لا سيما تلك التي تحتوي على كميات قليلة من قالب الحمض النووي أو قالب حمض نووي محطم، عندما يكون ببساطة تمييع الاستخراج غير مرغوب به.

في مستوى تجارب PCR المعيارية، النتائج السلبية أو عوائد منتجات منخفضة بشكل غير متوقع يمكن أن يكونا مؤشرا على التثبيط، شريطة أن القالب يجب أن يكون معروف أنه موجود. بدلا من ذلك، كمية معروفة من حمض نووي ريبوزي منقوص الأكسجين الحمض النووي غير الذاتية يمكن أن تضاف إلى عينة وتضخم كسيطرة إيجابية داخلية.

هذه الضوابط يمكن استخدامها في تفاعل البلمرة المتسلسل الكمي QPCR، مزودة تقييمات كمية لأدائها. واستنادا إلى عرض نماذج التفاعلات الحركية الفردية، وظأو حساب كفاءة التضخيم، QPCR يسمح بالتعرف على للعينات المثبطة دون الحاجة إلى توسيع داخلي إضافي متحكم به

استخدام انزيم بلمرة DNA، الذي هو أقل عرضة للآثار من المواد المثبطة، هو حل ممكن لبعض مشاكل تفاعل البلوليميراز المتسلسل PCR. على سبيل المثال، فإن عددا من انزيمات بلمرة ال DNA الأحدث ، مثل Tfl وrTth، هم أكثر موثوقية من الانزيم المبلمر Taq عند استخدام قوالب PCR مصنوعة من عينات لحمة أو جبنة. بالإضافة إلى ذلك، إن نشاط انزيم بلمرة DNA في حالة وجود مثبطات يمكن أن يتم تحسينه باستخدام بعض الميسرات كالمصل البقري ألبومين albumin، ثنائي ميثيل سلفوكسيد dimethyl sulfoxide، توين 20، تريتون-X والبيتين betaine.

العديد من المثبطات الكامنة لتفاعل البلمرة المتسلسل لم يتم التعرف عليها على الرغم من أن بعضها معروف. على سبيل المثال الحليب يحتوي على مستوى عالٍ من الأيونات الموجبة (2+Ca)، الأنزيمات الهاضمة للبروتين ، والإنزيمات الهاضمة للحموض النووية ،الأحماض الدهنية و الحمض النووي. وقد أظهرت الدراسات أن مستويات عالية من الزيت و ملح الطعام الملح ، و سكريات الكربوهيدرات، و حمض أميني الأحماض الأمينية ليس لها أي آثار مثبطة؛ بينما الكاسيين هيدروليستات(المادة الناتجة من تحلل بروتين الكاسيين الموجود في الحليب) ،Ca+2 ،و مكونات معينة من المرق المخصبة هي المثبطة لتفاعل البلمرة المتسلسل . بالإضافة الى، الهيم، أملاح الصفراء، والأحماض الدهنية، والأجسام المضادة، والكولاجين ومثبطات تفاعل البلمرة المتسلسل التي يمكن العثور عليها في عينات اللحوم و كبد الكبد . هذه المثبطات تمتلك تأثيرات متفاوتة على تفاعل البلمرة المتسلسل، وإن كانت بشكل عام ستجعل الكشف عن الأعداد القليلة من بكتيريا البكتيريا أو فيروس الفيروسات أكثر صعوبةً. مصدر مهم آخر من مثبطات تفاعل البلمرة المتسلسل هو المواد والكواشف التي تتلامس مع العينات أثناء معالجتها أو تنقية حمض نووي ريبوزي منقوص الأكسجين الحمض النووي .
مرجع كتاب
المؤلف1 Dr Patricia Hernandez-Rodriguez

العنوان Polymerase Chain Reaction

الطبعة

الصفحة

سنة

الناشر intechopen

الرقم المعياري 978-953-51-0612-8

تاريخ الوصول 30, May,

المكان

اللغة الإنكليزية

العنوان بالعربي تفاعل البوليميراز المتسلسل

أساليب كتابة تفاعل البوليمراز المتسلسل PCR

توصيف الجراثيم يعزل أدناه الأنواع، مستوى الأنواع يقوم بتحديد السلالات. أساليب الكتابة التي تصف الاختلافات بين الأنواع للكائن الحي يمكن أن تكون هامة لأسباب عديدة البحث عن أصل تفشي الأمراض المعدية (مثلا الطعام الملوث)؛ وهي تقوم بتربط الحالات فردية بالتفشي، دراسة الاختلافات في الإمراضية، مقدار حدة فيروس الفيروس والمقاومة بالطرق البيولوجية. كل هذا للبحث عن طرق لتعقب لتلوث الأغذية أو تتنع مصدر ميكروب الميكروبات ، واختيار بيئة بدائية لزرع الميكروبات وفحصها.

على مدى السنوات ال 25 الماضية، تطور تقنيات جزيئية مختلفة لدراسة مجموع مورثي جينوم الميكروبيات أدى إلى زيادة كبيرة في طرق كتابة ميكروب الميكروبات . الطريقة الأمثل للكتابة هي تسلسل الحمض النووي DNA sequence، التي تسمح بالتفريق الدقيق بين السلالات. إن هذه الطريقة مكلفة نسبيا، وهناك الكثير من أساليب الكتابة المعتمدة على حمض نووي ريبوزي منقوص الأكسجين الحمض النووي يتم استخدامها، وبعضها يمكن استخدامها مع تحليل PCR.

مرجع كتاب
المؤلف1 Dr Patricia Hernandez-Rodriguez

العنوان Polymerase Chain Reaction

الطبعة

الصفحة

سنة

الناشر intechopen

الرقم المعياري 978-953-51-0612-8

تاريخ الوصول 30, May,

المكان

اللغة الإنكليزية

العنوان بالعربي تفاعل البوليميراز المتسلسل

نمط التضخيم

عبر أي صنف من أصناف ميكروب الميكروبات ، الجينات المختلفة يمكن أن تكون متغيرة بشكل خاص، وبالتالي فإنها يمكن أن تستخدم لتحديد السلالة ضمن أصناف ميكروب الميكروبات .

تفاعل البلوليميراز المتسلسل متعدد الإرسال mPCR يقدم واحدة من الاحتمالات لفحص الجينات مختلفة. يوفر mPCR إمكانية تحليل متزامن للجينات المختلفة. هذه الجينات يمكن أن ترتبط بخبث الميكروب، والسموم، ومقاومته لمضادات الميكروبات، أو غيرها من الصفات للسلالات المختلفة. وجود أو غياب عوامل وراثية مختلفة يمكن الكشف عنها عن طريق mPCR، والتي يمكنها بعد ذلك تقديم التمايز للسلالات. تحليلmPCR amplicons يمكن أن تأديتها مع مادة هلامية كهربائية أو مباشرة عن طريق تفاعل البوليميرازالمتسلسل الكمي qPCR.

قام اكيبا وآخرون عام بتطبيق mPCR من أجل التعرف على السلالات الرئيسية السبعة لل السالمونيلا (التيفية الفأرية، كوليرا، الطفلية، الهدار، الملهبة، دبلن والدجاجي). لهذا mPCR، قاموا بشمل أحماض نووية من جين البداية invA للسالمونيلا مع جين جينات البداية المختصة ب serovar. باستخدام جينات البداية التي تستهدف جينات الخبث الستة (fliC, stx1, stx2, eae, rfbE, hlyA) في mPCR، هذا سمح بتمايز سلالات E. coli O157 H7 من الأنماط المصلية O25، O26، O55، O78، O103، O111، O127 وO145. كما تم التفريق بين سلالات يرسينيا القولون باستخدام mPCR، وفقا لوجود أو عدم وجود جين الجينات التي تشفر الخصائص المرتبطة الفوعة (الخبث)، من خلال استهداف جينات ystA، ail، myfA، و virF.

لقد تم تطوير تفاعل البلمرة المتسلسل متعدد الإرسال mPCR في دراسة أجراها Kérouanton وزملائه كطريقة بديلة وسريعة لمصل لستيريا مولدة للوحيدات الليستيريا Listeria monocytogenes serotyping. قام ساكاي وآخرون عام بكتابة سلالات المكورات العنقودية الذهبية (Staphylococcus aureus) بواسطة النظام الذي استخدم ثلاثة mPCRs على أساس تسلسل نوكليوتيد النوكليوتيدات للجينات المخثرة. هذا النظام سمح بالتمييز بين ثمانية أنواع رئيسية للبكتيريا العنقودية المخثرة staphylocoagulase (أنواع (l-Vlll، وثلاثة أنواع فرعية (VIa–VIc)، وهذا يمثل طريقة سريعة يمكن استخدامها كأداة الوبائية لعدوى بكتريا المكورة العنقودية الذهبية Staphylococcus aureus.

تم تمييز سلالات البكتريا المكورة العنقودية Staphylococcus aureus المعزولة من عينات المواد الغذائية المختلفة عن طريق وجود جين الجينات الأربع التي تشفر سموم معوية (SEA،SEB، SEC،SED).

الحمض النووي متعدد الاشكال والمضخم عشوائيا RAPD-PCR) )

يتم في هذه الحالة اختيار قطع من الحمض النووي دون العلم بتسلسل مجموع مورثي الجينوم له . وعلى هذا الاساس العشوائي العشوائي يتم اختيار من 6-10 أزواج من قواعد الجينوم يتم تضخيمهم و تغير في شكلهم تحت ظروف صارمة و صعبة. يتم الصلب على العديد من المواقع في الحمض النووي التمهيدي،وعندما يكون منطقتين معرضتين للاشعاع بطريقة صحيحة قريبتين من بعضهما يتم تضخيم التسلسل المتداخل ، النتيجة بعد فصل المواد الهلامية على جل الاغاروز هي اختلاف في البصمات عليه . العيب الرئيسي في هذه العملية هو اعادة الاستنساخ . تركيز الاشعاع وطوله يحسن من الاستنساخ .

ميزت السالمونيلا المعزولة من خلال البصمة الناتجة من هذه العملية واظهرت النتائج العلاقة بين التشكيلات الناتجة والسلالات وكان هناك تشابه كبير في خلايا الانسان المعزولة وخلايا الحيوانات المعزولة ايضا . استخدمت هذه التقنية في تحليل سلالات معزولة من بكتيريا اليسكلوباسلس الموجودة في عصير الفاكهة حيث اظهرت النتائج انها البكتيريا السائدة بغض النظر عن الانواع المختلفة في عصير الفواكه .وكمؤشر على الاوكراتوكسين يتم تشكيل خلايا معزولة من دقيق القمح، وتم فصل سلالة ال بنيسيليوم البنسيليوم الثؤلولية في مجموعات وفقا لبصمتها، كما تم استخدام RAPD-PCR للتمييز لسلالات بنيسيليوم البنسيليوم expansum, تم عزل هذه السلالات من التفاح السليم و المتعفن, ولكن ظهرت البصمة الجينية على الرغم من الضغوط تم تصنيفها إلى مجموعتين منفصلتين، جميع السلالات من P.expansum ممثلة على أنها من الأنواع الخطرة.

مرجع كتاب
المؤلف1 Dr Patricia Hernandez-Rodriguez

العنوان Polymerase Chain Reaction

الطبعة

الصفحة

سنة

الناشر intechopen

الرقم المعياري 978-953-51-0612-8

تاريخ الوصول 30, May,

المكان

اللغة الإنكليزية

العنوان بالعربي تفاعل البوليميراز المتسلسل

العناصر المتكررة من تفاعل البوليمرات المتسلسل

يعتمد على تكرار عناصر حمض نووي ريبوزي منقوص الأكسجين الحمض النووي ,يتم تكرار جين الجين الخارجي وتكرار الجين الداخلي للبكتيريا و توزيع وتكرار هذه العناصرمن الحمض النووي المتكررة يمكن دراستها مع تفاعل البوليمرات المتسلسل باستخدام بادئات موجهة ظاهريا التي هي محددة لعناصر تكرار. إذا العناصر المتكررة كانت قريبة بما فيه الكفاية لبعضها البعض، ممكن أن يحدث التضخيم في تسلسل الحمض النووي يتم فصل منتجات العناصر المتكررة باستخدام كهربائي الهلام الاغاروز . والبصمات التي يمكن الحصول عليها تدل على سلالة معينة تتمثل عناصر BOX عنصر آخر من أنواع الحمض النووي المتكرر.إذا العناصر المتكررة كانت قريبة بما فيه الكفاية لبعضها البعض، ممكن أن يحدث التضخيم في تسلسل الحمض النووي يتم فصل منتجات العناصر المتكررة باستخدام كهربائي الهلام الاغاروز والبصمات التي يمكن الحصول عليها تدل على سلالة معينة تتمثل عناصر BOX عنصر آخر من أنواع حمض نووي ريبوزي منقوص الأكسجين الحمض النووي المتكرر. تكنولوجيا فحص التفاعل المتسلسل متوفرة تجاريا ولا يستخدم فيها هلام الهلام وتجمع البيانات الناتجة تلقائيا وتحليلها باستخدام برنامج Diversilab المحوسب . على الرغم من اكتشاف عناصر حمض نووي ريبوزي منقوص الأكسجين الحمض النووي المتكررة في مجموع مورثي جينوم الكولاي والسالمونيلا الملهبة، قد وجدت هذه العناصر في وقت لاحق في عدة أنواع من البكتيريا سالبة جرام و موجبة جرام. تظهر جميع انواع الليستيريا توافق بين جينات جميع العناصر المتكررة أظهرت عملية تكرار العناصر لبكتيريا لستيريا مولدة للوحيدات اليستريا أن هناك أنواع منها ... وهذه الأنواع تكون وفقا للأصول التي تم عزلها منها.

مرجع كتاب
المؤلف1 Dr Patricia Hernandez-Rodriguez

العنوان Polymerase Chain Reaction

الطبعة

الصفحة

سنة

الناشر intechopen

الرقم المعياري 978-953-51-0612-8

تاريخ الوصول 30, May,

المكان

اللغة الإنكليزية

العنوان بالعربي تفاعل البوليميراز المتسلسل

التطبيقات

علاج الخلايا واستخراج الحمض النووي

الخطوة الأولى في عملية التحليل هي استخراج حمض نووي ريبوزي منقوص الأكسجين الحمض النووي (DNA) أو حمض نووي ريبوزي الحمض النووي الريبوزي (RNA) ، ونوعية العينة هي غالبا أهم عنصر لضمان استنساخ التحليل و الحفاظ على المعنى البيولوجي. وتحضير قالب الخلايا يتطلب تمزق أو تحلل الخلايا والفيروسات لتحرير حمض نووي ريبوزي منقوص الأكسجين الحمض النووي أو حمض نووي ريبوزي الحمض النووي الريبوزي حتى تخرج جزيئات الحمض النووي من النواة يجب أن يتم ازالة جدار الخلية عن طريق تحليله.عادة يتم اختيار الطريقة الأمثل لتحليل الخلية بناءً على حد الكشف عن تفاعل البوليميراز المتسلسل ، السرعة، سهولة الإعداد و الطلب.فعالية هذا الاستخراج النووي تعتمد على عدد من ميزات جدار الخلية البكتيرية ،و طريقة المعالجة المستخدمة يمكن أن تكون حرارية، كيميائية ، ميكانيكية، باستخدام المنظفات ، المذيبات ، باستخدام الانزيمات أو صدمة الضغط الإسموزي .

من السهل نسبيا في الوقت الحاضر فصل حمض نووي ريبوزي منقوص الأكسجين الحمض النووي بكمية و نوعية عالية الإنتاجية. معظم الخطوات المتبعة تستخدم مجموعات استخراج تجارية و اعتماداً على شبكة الطعام يمكن أن تعطي نتائج مرضية حسب ما يتم توفيره أو بعد بعض التعديلات.هناك مجموعات استخراج تجارية مختلفة متاحة لإستخراج حمض نووي ريبوزي منقوص الأكسجين الحمض النووي باستخدام الكيمياء الحيوية مثل د.فود(دكتور شيب بيوتك انك، مياو لي تايوان )،بريب مان)تكنولوجيا الحياة،كارلسباد،الولايات المتحدة الأمريكية) ،2001)،بيورجين(شركة أنظمة جينترا ، مينيابوليس، مينيسوتا، الولايات المتحدة الأمريكية)

فاهل والتحقيق، سان دييغو، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية) جين-تراك (جين-تراك أنظمة كورب، هوبكينتون، الولايات المتحدة الأمريكية باكس كواليكون شركة، ويلمنجتون، ،(داهلينوبورج DE) (بيلي، 1998)،بروبيليا (سانوفي باستور التشخيص،مارنيس-لا-المغناج، فرنسا)، وتاكمان (تقنيات الحياة، كارلسباد، الولايات المتحدة الأمريكية)

كما تم الإعلان عن فحص تفاعلي لتاكمان للكشف عن الأنماط المصلية لفيروس الروتا في العينات السريرية و البيئية . و بعكس الحمض النووي (DNA) فإن استخراج الحمض النووي الريبوزي(RNA) أكثر اجهاداً خاصة عندما يتم استخراجه من مركب معقد أو من الأنسجة الغشائية للأطعمة الدهنية، وقد تم تطوير بعض أساليب الاستخراج التي تتوافق مع النسخ العكسي المتتابع لتفلعل البلمرة المتسلسل (QPCR) لمختلف الأطعمة. نظراً للتحلل السريع للحمض الريبوزي ( حمض نووي ريبوزي RNA )فلابد من تحليله بسرعة . المرحلة النهائية من إعداد نموذج (عزل وتنقية الحمض النووي) يمكن استخدامها مع مركب من طرد مركزي تبايني الطرد المركزي المكثف والتنقية عن طريق الإستخراج اللوني باستخدام الفينول كلوروفورم، وهطول الأمطار مع الإيثانول، والعلاج مع إنزيم الأنزيمات (على سبيل المثال lizocim). الطريقة الأكثر فاعلية لإزالة ما تبقى من الشوائب الأخرى مع التركيز أيضا على العينة هو الاستخراج مع المذيبات العضوية و ترسيب الحمض النووي باستخدام إيثانول الإيثانول .

مرجع كتاب
المؤلف1 Dr Patricia Hernandez-Rodriguez

العنوان Polymerase Chain Reaction

الطبعة

الصفحة

سنة

الناشر intechopen

الرقم المعياري 978-953-51-0612-8

تاريخ الوصول 30, May,

المكان

اللغة الإنكليزية

العنوان بالعربي تفاعل البوليميراز المتسلسل

تفاعل البوليميرازالمتسلسل القائم على الكشف عن البكتيريا التي تنتقل عن طريق الأغذية

هناك العديد من الطرق المعتمدة على تفاعل البوليميراز المتسلسل للكشف عن كائن حي دقيق الكائنات الحية الدقيقة التي ورد ذكرها في الكتابات العلمية. وهناك أيضا عدد من المقايسات المتاحة تجاريا القائمة على فحص تفاعل البلوليميراز المتسلسل التي تملك الملاءمة لتوفير الكواشف والضوابط اللازمة لإجراء الفحص والتي يبدو أن لها حساسية عالية للكشف عن تلوث كائن حي دقيق الكائنات الحية الدقيقة .

التكبير والتقدير الكمي للدنا

تشخيص الأمراض

تستخدم في الكشف عن الفايروسات في شريط الحامض الاميني

تستخدم في الادله الجنائية وقضايا تحديد النسب

تستخدم في البصمة

تستخدم لمعرفة طول شريط DNA

تستخدم لتحديد موقع جين معين ضمن سلسلة من الجينات

تستخدم في الكشف عن الطفرات الوراثية

التعديلات في التكنيك الأساسي

تاريخ

حروب براءات الاختراع

PCR tubes.png 250 أنابيب بلاستيكية يحوي كل منها على 100خ¼l من مزيج تفاعل PCR

G-Storm thermal cycler تصغير جهاز اختبار تفاعل البوليميرز المتسلسل PCR


تفاعل البوليميراز المتسلسل إنج Polymerase chain reaction هي طريقة مستخدمة بكثرة في علم الأحياء الجزيئي البيولوجيا الجزيئية . يشتق اسمه من إحدى عناصره الأساسية وهو دنا بوليميريز والذي يستخدم لتكثير و تكوين نسخ عديدة من قطعة من حمض نووي ريبي منقوص الأكسجين الحمض النووي من خلال تناسخ إنزيم ي خارج الكائنات الحية. عندما يتطور التفاعل، فإن الحمض النووي المصنع يستخدم كقالب للتناسخ. وذلك يُنشط تفاعل تسلسلي تفاعل متسلسل والذي يحدث فيه تكبير نمو أسي أسي لقالب DNA. من الممكن، من خلال هذا التفاعل عمل ملايين النسخ لقطعة مفردة من الدنا أو عدة قطع. يمكن تعديل تفاعل البوليميريز المتسلسل لعمل هندسة وراثية تعديلات وراثية عديدة.



تستخدم كل تطبيقات تفاعل البوليميريز المتسلسل دنا بوليمريز مستقر حراريا، مثل تاك بوليمريز وهو إنزيم عزل من بكتيريا بكتريا مستحرة مائية المستحرة المائية . يعمل هذا الإنزيم على تجميع خيط دنا جديد من نوكليوتيد النيوكليوتيدات (مكعبات بناء الدنا)، وذلك باستعمال خيط دنا مفرد كقالب و قليل النيكليوتيدات قليلات النيوكليوتيدات (تسمى أيضا مشرع بوادئ الدنا ) وهي مطلوبة لبدأ تصنيع الدنا. معظم طرق تفاعل البلمرة المتسلسل تستخدم مدور حراري التدوير الحراري بمعنى أنه يتم تسخين وتبريد عينة تفاعل البوليميريز المتسلسل وذلك طبقا لسلسلة خطوات حرارية محددة.


وضعت في عام 1983 من قبل كاري موليس ، والآن هذه التقنية لا يستغنى عنها في كثير من الأحيان ويتم استخدمها في مختبرات البحوث الطبية والبيولوجية لمجموعة متنوعة من التطبيقات وتشمل هذه استنساخ DNA المتسلسل المعتمدة على الحمض النووي , علم الوراثة العرقي ، أو التحليل الوظيفي من الجينات ، وتشخيص الأمراض الوراثية ، وتحديد بصمات الوراثية (المستخدمة في علوم الطب الشرعي و اختبار الأبوة )، وكشف وتشخيص الأمراض المعدية , في عام 1993، حصل على جائزة موليس على جائزة نوبل في الكيمياء مع مايكل سميث لعمله على PCR